【摘要】：目的:明確褪黑素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)條件下通過抑制環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)對Hep G2肝癌細胞凋亡水平的影響,及其分子機制進行初步探討。方法:通過免疫組化法檢測COX-2、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6,ATF-6)、肌醇需求激酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE-1)、雙鏈RNA激活的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)在肝癌組織中的表達并分析未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)信號通路與COX-2表達的相關(guān)性。用Western blot檢測不同濃度褪黑素對Hep G2肝癌細胞中三條UPR通路蛋白表達變化情況,使用小干擾RNA(Small interfering RNA,si RNA)分別干擾UPR三條通路的表達,使用Western blot技術(shù)檢測COX-2蛋白以及RT-q-PCR法檢測COX-2 m RNA的表達,從而了解UPR通路與COX-2表達的相關(guān)性。Western blot法檢測COX-2、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白的同源蛋白(C/EBP homologous protein 10,CHOP)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)以及Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associaed X protein,Bax)表達的變化,進而了解褪黑素對Hep G2肝癌細胞凋亡的影響。TUNEL法、Annexin V+PI雙染流式細胞術(shù)觀察褪黑素轉(zhuǎn)染ATF-6 si RNA對Hep G2肝癌細胞凋亡的相關(guān)機制。結(jié)果:1.肝癌組織中UPR信號通路與COX-2的相關(guān)性:采用免疫組化法檢測COX2、ATF-6、IRE-1、PERK的表達并分析其相關(guān)性,結(jié)果顯示:100例肝癌患者中,研究發(fā)現(xiàn)COX-2陽性組,ATF-6的陽性率為87%,IRE-1的陽性率為60%,PERK的陽性率為60%,COX-2陰性組中ATF-6的陰性率為29%,IRE-1的陰性率為55%,PERK為53%。相關(guān)性分析顯示,COX-2和ATF-6的表達呈正相關(guān)(P=0.011),與IRE-1(P=0.086)及PERK(P=0.134)無相關(guān)性。2.不同濃度褪黑素對Hep G-2肝癌細胞UPR信號通路的影響:濃度為3μmol/L的衣霉素預(yù)處理Hep G-2肝癌細胞8小時后,預(yù)計設(shè)4個褪黑素濃度組(10-9、10-7、10-5、10-3mmol/L),以不加褪黑素為空白對照。褪黑素作用于Hep G-2肝癌細胞24小時,使用Western blot檢測三條UPR通路蛋白表達變化,最后結(jié)果證明10-5mmol/L及10-3mmol/L濃度的褪黑素可有效抑制ATF-6、IRE-1及PERK三條UPR通路的表達,有統(tǒng)計學意義,其中10-5mmol/L考慮系褪黑素藥理濃度,故選用該濃度作為后續(xù)處理細胞的濃度。3.Western blot檢測si RNA干擾效率:分別將PERK、IRE-1和ATF-6通路中的三條si RNA同源序列轉(zhuǎn)染Hep G-2中,24小時后提取肝癌細胞總蛋白,分別檢測各組同源序列阻斷后PERK、IRE-1和ATF-6蛋白的表達情況。結(jié)果顯示:si-PERK和si-IRE-1各有兩條同源序列明顯抑制PERK和IRE-1的表達,si-ATF6-1的抑制作用最明顯;后期實驗選擇抑制作用較強si-PERK-3和si-IRE1-3進行特異性阻斷UPR通路。4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后Hep G2肝癌細胞UPR通路與COX-2表達的相關(guān)性:為了解三個UPR通路與COX-2表達的相關(guān)性,使用濃度為3μmol/L的衣霉素預(yù)處理Hep G2肝癌細胞8小時,分別轉(zhuǎn)染ATF-6、IRE-1及PERK三條通路的si-RNA進行干擾,24小時后提取各組COX-2蛋白進行Western blot檢測和定量RT-PCR檢測m RNA含量,結(jié)果均顯示,TM組COX-2表達較空白對照組明顯增加,而si-ATF-6組COX-2表達較TM組明顯降低,有統(tǒng)計學意義(P0.01),而si-IRE-1及si-PERK表達無明顯變化。5.轉(zhuǎn)染ATF-6 si RNA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后Hep G-2肝癌細胞的影響;3μmol/L衣霉素預(yù)處理Hep G-2肝癌細胞用8小時后轉(zhuǎn)染ATF-6 si RNA作用24小時,使用Annexin V-PI雙染流式細胞術(shù)及TUNEL法技術(shù)觀察Hep G-2肝癌細胞凋亡情況。結(jié)果均顯示ATF-6 si RNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組和只加衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激組相比,凋亡比例均明顯增加,有統(tǒng)計學意義(P0.01)。6.褪黑素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后HepG2肝癌細胞凋亡的通路:3μmol/L衣霉素預(yù)處理Hep G2肝癌細胞8小時后,分別加入10-5mmol/L濃度的褪黑素作用24小時或轉(zhuǎn)染ATF-6 si RNA作用6小時,設(shè)置空白對照組、單獨衣霉素組、加褪黑素組、及加ATF-6 si RNA轉(zhuǎn)染組,Western blot檢測四組中COX-2和CHOP、Bcl-2及Bax凋亡相關(guān)蛋白水平變化。結(jié)果顯示,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后的Hep G2肝癌細胞中,加褪黑素組和加ATF-6 si RNA轉(zhuǎn)染組CHOP、Bax表達均顯著上升,Bcl-2的表達下降,Bcl-2/Bax比值顯著降低,有統(tǒng)計學差異(P0.01)。7.比較褪黑素和轉(zhuǎn)染ATF-6 si RNA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后Hep G-2肝癌細胞凋亡的影響:3μmol/L衣霉素預(yù)處理Hep G2肝癌細胞8小時后,分別加入10-5mmol/L濃度的褪黑素作用24小時或轉(zhuǎn)染ATF-6 si RNA作用6小時,設(shè)置空白對照組、單獨衣霉素組、加褪黑素組、及加ATF-6 si RNA轉(zhuǎn)染組,使用Annexin V-PI雙染流式細胞術(shù)及TUNEL法觀察四組Hep G-2肝癌細胞凋亡情況。與空白對照組相比,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后可輕度誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡(P0.05)。而加褪黑素組和加ATF-6 si RNA轉(zhuǎn)染組,與單獨衣霉素組比較,細胞凋亡率均顯著增加(P0.01)。結(jié)論:1.COX-2和ATF-6的表達呈正相關(guān),抑制ATF-6可以抑制COX-2的表達,從而表明過表達的COX-2可能與ATF-6通路的激活相關(guān)。2.抑制ATF-6可增加細胞凋亡,ATF-6可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后Hep G2肝癌細胞的凋亡抵抗。3.褪黑素可能通過抑制ATF-6通路下調(diào)COX-2表達,進而增加Hep G2肝癌細胞凋亡。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Jing Guo;Xin-Xin Li;Jiao-Jiao Feng;Chen-Yang Yin;XueJun Wang;Ning Wang;Li Yuan;;Inositol-requiring enzyme 1α is required for gut development in Xenopus lavies embryos[J];World Journal of Gastroenterology;2013年02期

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本文編號：2447886