發(fā)布時(shí)間：2019-03-25 08:20

【摘要】：目的1.系統(tǒng)總結(jié)單中心按WHO-2008診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的成人混合表型急性白血病(MPAL)患者,分析其臨床、形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)(MIC)特征。2.應(yīng)用靶向外顯子捕獲+重測(cè)序技術(shù)及微陣列比較基因組雜交(array-CGH)技術(shù)對(duì)部分MPAL患者進(jìn)行了基因突變的篩選及DNA拷貝數(shù)變異(CNVs)的檢測(cè),闡述MPAL的分子遺傳學(xué)特征。3.闡述MEF2C基因在急性髓系白血病中的的臨床意義及生物學(xué)效應(yīng)。方法1.從1998年1月至2011年7月期間于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的4780例確診的急性白血病中,按照WHO-2008標(biāo)準(zhǔn)篩選MPAL,收集患者初診時(shí)白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板以及形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等資料;對(duì)于部分在我中心治療的MPAL患者,分析其臨床治療方案及預(yù)后。2.收集MPAL患者初診時(shí)骨髓單個(gè)核細(xì)胞,采用多重巢式RT-PCR方法對(duì)42例MPAL患者進(jìn)行白血病常見(jiàn)的29種融合基因的檢測(cè);采用基因組DNA-PCR方法對(duì)31例MPAL患者擴(kuò)增C-KIT、NPM1、FLT3-TKD、FLT3-ITD、EZH2、RUNX1、ASXL1、IDH1、IDH2、CBL、WT1、TET2、DNMT3、PHF6、FBXW7、NOTCH1和ETV6共16種基因,PCR產(chǎn)物用直接測(cè)序法分析是否存在基因突變,另外IKZF1基因是否存在變異采用RT-PCR和毛細(xì)管電泳方法檢測(cè);利用人外顯子捕獲芯片對(duì)28例MPAL患者進(jìn)行了與腫瘤發(fā)生相關(guān)的500種基因變異的分析;利用人安捷倫244k的CGH芯片對(duì)12例MPAL患者進(jìn)行了基因拷貝數(shù)的檢測(cè),闡述MPAL患者的分子遺傳學(xué)特征。3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)我中心83例初診成人AML患者的骨髓液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞、12例正常對(duì)照骨髓液?jiǎn)蝹�(gè)核細(xì)胞中MEF2C基因m RNA表達(dá)水平。比較MEF2C基因m RNA表達(dá)水平在AML患者和正常對(duì)照之間以及AML各亞組之間的差異。分析MEF2C基因m RNA表達(dá)水平與AML患者無(wú)事件生存(EFS)、總體生存(OS)的關(guān)系。同時(shí)制備MEF2C過(guò)表達(dá)載體及靶向抑制MEF2C的sh RNA慢病毒載體,分別侵染髓系白血病細(xì)胞株Dami,采用絕對(duì)計(jì)數(shù)等方法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果1.117例MPAL患者臨床及MIC特征分析從1998年1月至2011年7月期間在我中心確診的4780例急性白血病患者中,根據(jù)2008年WHO標(biāo)準(zhǔn)共篩選出117例(2.4%)患者可以被確診為MPAL(60例男性和57例女性),中位年齡為35歲(14-81歲)。MPAL患者初診時(shí)在骨髓原始細(xì)胞比例、血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)方面與其它類(lèi)型急性白血病無(wú)明顯差異,但高白細(xì)胞計(jì)數(shù)和肝脾腫大相對(duì)多見(jiàn)。依照FAB分型標(biāo)準(zhǔn),40例(34%)的患者表現(xiàn)為AML,M1和M5多見(jiàn)。51例(44%)的患者被歸為ALL-L1,其余26例(22%)患者依據(jù)形態(tài)學(xué)無(wú)法分類(lèi),被歸為不能分類(lèi)的急性白血病。117例患者中有64例(55%)為B淋系和髓系混合表達(dá),38例(33%)為T(mén)淋系和髓系的混合表達(dá),14例(12%)為B淋系和T淋系混合表達(dá),另一例(0.9%)為T(mén)、B和髓三系混合表達(dá)。B和T淋系混合表達(dá)的MPAL多見(jiàn)于男性,14例T和B淋系混合表達(dá)的病例中有11例(79%)為男性,與其他兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.01)。82%的病例顯示了白血病細(xì)胞表面存在CD34的高表達(dá)。在92例能成功進(jìn)行核型分析的MPAL病例中,33例(36%)患者未發(fā)現(xiàn)核型異常,而59例(64%)患者顯示了核型異常。其中復(fù)雜核型異常(≥3種異常)最為常見(jiàn)(22/92例;24%)。14例(15%)患者存在t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1融合基因陽(yáng)性,且均為B+My混合表型。7例患者(7/92;7.6%)存在單體7;7例患者(7/92;7.6%)有21多體。5例患者(5/92;5.4%)患者存在+8異常,且均為B+My混合表型。4例患者(4/92;4.3%)存在t(v;11q23)/MLL重排異常,其中兩例為t(11;19)(q23;p13)、1例為t(4;11)(q21;q23)、1例為t(9;11)(p22;q23)。3(3/92;3.3%)為t(10;11)(p15;q21),其中兩例為T(mén)+My混合表達(dá),1例為B+T淋系混合表達(dá)。在另外3例患者中發(fā)現(xiàn)了三種迄今為止尚未報(bào)道過(guò)的染色體易位,1例B+My患者為t(7;9)(q32;p24),1例B+T患者為t(2;9)(q13;q34),另1例T+My患者為der(9)t(9;11)(p21;q12)。在1例核型分析為t(3;11)(q29q13;p15)del(3)(q29)的患者中發(fā)現(xiàn)了最近報(bào)道過(guò)一種新的融合基因,即NUP98和IQCG基因的融合。34例初治MPAL的患者在我中心接受了治療。24例患者接受了兼顧淋系和髓系的聯(lián)合方案,14例(58%)取得了完全緩解(CR),另外10例接受CAG方案誘導(dǎo)治療的患者中7例(70%)取得了緩解。在CR率上兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.802)。其中6例采用聯(lián)合方案誘導(dǎo)失敗的患者中采用CAG方案再誘導(dǎo)化療,有5例(83%)患者再次獲得了CR。而且8例接受異基因造血干細(xì)胞移植的患者總生存優(yōu)于單純化療組的MPAL患者(中位生存時(shí)間分別為22個(gè)月和9個(gè)月;P=0.004)。2.MPAL患者的分子遺傳學(xué)特征研究多重巢式RT-PCR結(jié)果:12例(28.6%)患者檢測(cè)到存在BCR/ABL融合基因(其中7例患者在染色體核型檢查時(shí)也發(fā)現(xiàn)了Ph染色體)。3例染色體核型正常的MPAL患者中,我們分別檢測(cè)到SIL/TAL1融合基因(1p32微缺失所致),dup MLL基因重排和MLL/AF9融合基因各1例。另外我們還在1例伴有t(16;17)等復(fù)雜核型異常的MPAL患者中檢測(cè)出SET/CAN融合基因�；蛲蛔兎植技鞍l(fā)生率:31例MPAL患者采用PCR、Sanger、毛細(xì)管電泳等技術(shù)進(jìn)行了17個(gè)基因的突變檢測(cè),其中12例患者(39%)檢出≥1種基因突變,包括IKZF1缺失4例(4/31;13%)、EZH2突變3例(3/31;9.7%)、ASXL1突變2例(2/31;6.5%);ETV6、NOTCH1和TET2突變各1例(1/31;3.2%)。31例患者中,11例成功進(jìn)行了核型分析,發(fā)現(xiàn)10例患者存在核型異常。8例伴t(9;22)(q34;q11)和B+My異常的MPAL患者有4例(50%)檢測(cè)到IKZF1缺失。對(duì)其中24例患者的預(yù)后進(jìn)行了分析,突變陽(yáng)性和陰性組的患者之間未發(fā)現(xiàn)明顯的生存差異(P=0.158)。外顯子捕獲測(cè)序分析:28例MPAL患者進(jìn)行了人外顯子捕獲和測(cè)序,結(jié)果與人參考的基因組(Hg19)相比較,剔除SNPs。顯示42.9%(12/28)具有表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因的突變,最常見(jiàn)的突變?yōu)镋ZH2基因突變(4/28;14.3%),3例T淋系和髓系混合表達(dá)的MPAL中發(fā)現(xiàn)了DNMT3A基因突變(3/28;10.7%),GATA2和TET2基因突變各2例(7.1%),1例MPAL患者中發(fā)現(xiàn)存在IDH1基因突變。上述突變的患者部分還伴有其它基因異常,如NOTCH1和TP53基因。未發(fā)現(xiàn)其它表觀遺傳學(xué)相關(guān)調(diào)控基因存在突變,如KRAS、NRAS、CREBBP和NF1等。在此組病例中,還同時(shí)發(fā)現(xiàn)另外9例MPAL患者中存在IKZF1(4/28;14.3%)、ASXL1(2/28;7.1%)、RUNX1(2/28;7.1%)和ETV6(1/28;3.6%)四種重要轉(zhuǎn)錄因子的基因變異(共占32.1%)。本研究中共發(fā)現(xiàn)75%的成人MPAL患者在初診時(shí)存在體細(xì)胞水平的基因變異。array-CGH分析結(jié)果:12例MPAL患者進(jìn)行了array-CGH分析,發(fā)現(xiàn)每例患者至少有一種基因組異常,共發(fā)現(xiàn)68種基因組異常,平均每例樣本有5.7種異常。在此組MPAL病例中,我們新發(fā)現(xiàn)了幾種隱匿性的拷貝數(shù)異常,如CDKN2A(4/12)、IKZF1(3/12)、MEF2C(2/12),同時(shí)還發(fā)現(xiàn)BCOR、EBF1、KRAS、LEF1、MBNL1、PBX3和RUNX1異常各1例(8.3%)。3.MEF2C在成人AML患者中的表達(dá)、意義及其功能的初步探討(1)AML患者M(jìn)EF2C基因m RNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(P值=0.0377)。按FAB分型分組:FAB-M5亞組AML患者M(jìn)EF2C基因m RNA表達(dá)水平明顯高于FAB-M1、M2、M4亞組(P值分別為0.029、0.003、0.021);FAB-M3亞型組AML患者M(jìn)EF2C基因m RNA表達(dá)水平明顯低于其它組(P值均0.001);而FAB-M1/M2、M1/M4、M2/M4組間AML患者的MEF2C基因m RNA表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.2、0.055、0.279)。按染色體核型進(jìn)行分組,其它核型AML患者組MEF2C基因m RNA表達(dá)水平高于CBF-AML和正常核型組(P值分別為0.036和0.033);伴有t(15;17)異常的AML患者組MEF2C基因m RNA表達(dá)水平明顯低于其它核型組(P=0.003)。(2)采用Kaplan-Meier分析,正常核型AML患者中MEF2C基因m RNA低表達(dá)組和高表達(dá)組患者3年EFS分別為56%和20%,MEF2C基因m RNA低表達(dá)組的EFS優(yōu)于高表達(dá)組(P=0.048);低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的3年OS分別為40%和16%(P=0.07)。而MEF2C基因m RNA表達(dá)與CBF-AML及其它中危核型患者的預(yù)后沒(méi)有關(guān)系,EFS和OS差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均0.05)。(3)使用兩條獨(dú)立的sh RNA序列能有效抑制髓系細(xì)胞株Dami細(xì)胞中的MEF2C表達(dá),沉默MEF2C使髓系細(xì)胞株Dami細(xì)胞的生長(zhǎng)及集落形成能力下降。但在Dami細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)MEF2C未見(jiàn)到對(duì)其增殖能力造成明顯影響。結(jié)論1.成人MPAL是一組異質(zhì)性較大的疾病,在急性白血病中發(fā)生率為2.4%。MPAL以B淋系和髓系混合表達(dá)最為常見(jiàn),64.1%的患者存在細(xì)胞遺傳學(xué)異常,其中以復(fù)雜核型和Ph染色體異常相對(duì)常見(jiàn)�，F(xiàn)有化療方案預(yù)后差,異基因造血干細(xì)胞移植有可能改善其長(zhǎng)期生存。2.多重巢式PCR技術(shù)可以提高M(jìn)PAL患者基因重排的檢出率。MPAL患者中存在高頻率的基因變異率,75%的成人MPAL患者在初診時(shí)可以被檢出存在基因變異,包括表觀遺傳學(xué)相關(guān)基因(42.9%)和重要轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)基因(32.1%)。3.在2例MPAL患者中首次發(fā)現(xiàn)存在再現(xiàn)性的轉(zhuǎn)錄因子MEF2C的新激活方式-基因缺失。AML患者中MEF2C基因m RNA表達(dá)水平明顯升高,對(duì)于正常核型AML患者而言,熒光實(shí)時(shí)定量檢測(cè)MEF2C基因m RNA表達(dá)水平有提示預(yù)后的價(jià)值;沉默MEF2C基因表達(dá)能抑制AML細(xì)胞株Dami的增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R733.71

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 董莎莎;惡性血液病中ETV6基因突變的研究[D];蘇州大學(xué);2012年

，

本文編號(hào)：2446807