【摘要】：背景和目的 肺癌是世界上致死率最高的癌癥,可分為小細胞肺癌(SCLCs)和非小細胞肺癌(NSCLCs)兩類,其中非小細胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%。肺癌預后極差,一般來說5年生存率大約為15%�；虬邢蛑委熞呀�(jīng)成為新的肺癌治療方向,了解肺癌的發(fā)生、發(fā)展機制,發(fā)現(xiàn)和認識新的治療靶點以用于肺癌的診斷和治療,對我們早日攻克腫瘤有的重要意義。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是在真核細胞中廣泛存在非編碼單鏈RNA,長度大約22個核苷酸,mi RNA能夠通過和靶基因m RNA的3’UTR區(qū)堿基配對從而參與基因轉錄后的水平調(diào)控,對生物體的生長、分化、增值、凋亡等發(fā)揮調(diào)控作用。mi RNA表達異常會導致腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生,目前關于mi RNA和腫瘤相關性的研究成為眾多科學家關注的熱點之一,mi RNA可能成為腫瘤診斷、治療以及預后判斷新的靶點。mi R-335定位于人染色體7q32.2處,在正常組織中廣范表達。研究發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中扮演著復雜的角色。在胃癌、乳腺癌中mi R-335呈現(xiàn)低表達,高表達mi R-335可以導致腫瘤的侵襲和轉移能力降低。而在星型細胞瘤中剛發(fā)現(xiàn)mi R-335高表達可以促進腫瘤侵襲和轉移的作。因而mi R-335的不同作用可能具有組織特異性,目前關于mi R-335在非小細胞肺癌細胞的生物學作用及調(diào)控的分子機制仍然不是很清楚。本課題計劃包含以下三部分:第一部分:非小細胞肺癌組織中mi R-335和Sp1、Bcl-w表達及與臨床病理學特征相關性分析;第二部分:上調(diào)mi R-335表達對非小細胞肺癌細胞系A549生物學作用的影響;第三部分:mi R-335對Sp1、Bcl-W轉錄后調(diào)控作用機制的初步研究。第一部分非小細胞肺癌組織中mi R-335和Sp1、Bcl-w表達及與臨床病理學特征相關性分析方法： 1.收集手術切除的72例非小細胞肺癌組織及相對應的癌旁正常組織標本。2.采用Agilent mi RNA芯片檢測3例非小細胞肺癌組織及相對應的癌旁正常組織標本中mi RNA表達情況,分析差異化表達的mi RNA。3.運用q RT-PCR檢測72例樣本中miR-335和Sp1、Bcl-w mRNA表達,Spearman相關分析mi R-335表達與Sp1/Bcl-w m RNA表達的相關性。4.Western-blot檢測Sp1和Bcl-w蛋白表達5.分析mi R-335和Sp1、Bcl-w mRNA的表達水平與非小細胞肺癌病人性別,年齡、腫瘤分化、TNM分期及有無淋巴結轉移之間的相關性。6.應用SPSS18.0.軟件進行統(tǒng)計分析,檢驗水準а=0.05。結果： 1.Agilent mi RNA芯片檢測分析顯示共有56個mi RNAs在非小細胞肺癌組織中表達異常,其中26個mi RNAs表達上調(diào),30個mi RNAs表達下調(diào)。mi R-335在非小細胞肺癌中呈低表達(P0.05)。2.q RT-PCR檢測顯示在非小細胞肺癌組織中,mi R-335表達水平較正常組織顯著降低(P0.05),其表達水平和Sp1、Bcl-w的m RNA表達水平呈負相關(R2分別為0.5231和0.6375)。3.非小細胞肺癌組織中mi R-335的表達水平與患者的淋巴結轉移情況、分化程度以及TNM分期有關(P0.05)。第二部分上調(diào)mi R-335表達對非小細胞肺癌細胞系A549生物學作用的影響方法：1.合成mi R-335前體序列,在其兩端引入XhoⅠ和Eco RⅠ酶切位點,將其克隆到慢病毒載體p GV中,構建慢病毒載體p GV-mi R-335。2.將p GV-mi R-335、p Helper 1.0、p Helper 2.0質粒共轉染至慢病毒包裝細胞HEK-293T中,包裝產(chǎn)生慢病毒并測定滴度。3.慢病毒感染A549細胞,篩選得到穩(wěn)定感染的細胞株,q RT-PCR檢測慢病毒感染后A549細胞中mi R-335表達。4.將細胞分為三組:實驗組(重組mi R-335慢病毒感染細胞),無關對照組(mi R-NC慢病毒感染細胞);空白組(未感染A549細胞)。5.CCK-8法、平板克隆形成實驗檢測各組細胞增殖和生長能力。6.AnncxinV-FITC/PI雙標記流式細胞術、Hoechst染色、Caspase-3檢測各組細胞凋亡情況。7.Transwell小室實驗、劃痕實驗檢測各組細胞侵襲轉移能力8.裸鼠移植瘤實驗檢測miR-335過表達對非小細胞肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的影響。結果： 1.經(jīng)雙酶切鑒定和測序表明成功構建了含有mi R-335的慢病毒載體,其感染A549細胞后mi R-335的相對表達量較空白細胞組和無關對照組顯著升高(P0.01)。2.CCK-8法檢測結果顯示mi R-335組細胞較無關對照組以及空白對照組吸光度顯著減少。平板克隆形成實驗結果顯示mi R-335組細胞克隆形成數(shù)較空白對照組細胞和無關對照組著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.Anncxin V-FITC/PI雙標記流式細胞術和Hoechst染色檢測顯示重組mi R-335慢病毒感染后A549細胞凋亡率較空白對照組和無關對照組顯著升高,Caspase-3細胞活性較空白對照組和無關對照組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)實驗組穿膜細胞數(shù)為(20.7±2.6)個,較空白對照組和無關對照組顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。劃痕實驗顯示重組mi R-335慢病毒感染A549細胞后,實驗組劃痕48h后劃痕愈合速度明顯慢于空白對照組和無關對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.裸鼠移植瘤實驗表明實驗組瘤塊體積較正常對照組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。第三部分mi R-335對SP-1、Bcl-W轉錄后調(diào)控作用機制的初步研究方法： 1.通過生物信息學分析推測mi R-335的候選靶基因。2.構建重組載體pmirGLO-w-Sp1、pmir GLO-mut-Sp1、pmir GLO-w-Bcl-w、pmir GLO-mut-Bcl-w。采用雙熒光素酶報告實驗驗證mi R-335的靶基因。3.構建表達載體pc DNA3.1-Sp1、pc DNA3.1-Bcl-w,通過回復實驗分析mi R-335對A549生物學活性的調(diào)控。4.設計靶向Sp1和Bcl-w的si RNA序列,轉染至A549細胞。分為以下5組:未轉染的A549細胞(Blank組)、mi R-335慢病毒感染的A549細胞(mi R-335組)、Sp1 si RNA干擾表達的A549細胞(SP↓組),Bcl-w si RNA干擾表達的A549細胞(Bcl-w↓組),Sp1 si RNA和Bcl-w同時干擾表達的A549細胞(SP↓Bcl-w↓組)。q RT-PCR、Western blot檢測各組細胞Sp1/Bcl-w m RNA和蛋白表達,CCK-8法檢測各組細胞增殖,Anncxin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測各組凋亡,Transwell小室實驗檢測各組侵襲能力的變化結果： 1.生物信息學分析推測Sp1、Bcl-w為mi R-335靶基因。2.雙熒光素酶報告實驗顯示mi R-335可以與Sp1、Bcl-w的3'UTR區(qū)結合,對其表達產(chǎn)生負調(diào)控作用。3.將不含Sp1和Bcl-w3'UTR區(qū)的重組載體pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Bcl-w轉染至A549細胞后,可以回復mi R-335對Sp1和Bcl-w蛋白表達的負調(diào)控作用,同時回復了mi R-335抑制A549細胞轉移,促進細胞凋亡的能力。4.過表達mi R-335在A549細胞中可以起到和Sp1和Bcl-w si RNA相似的生物學效應,且較si RNA干擾能更有效的抑制A549細胞增殖、促進細胞凋亡。結論： 1.共有56個mi RNAs在非小細胞肺癌組織中表達異常,其中26個mi RNAs表達上調(diào),30個mi RNAs表達下調(diào)。在非小細胞肺癌組織中,mi R-335表達水平較正常組織顯著降低。其表達水平與患者的淋巴結轉移、分化程度以及TNM分期有關。2.成功建立了高表達mi R-335的非小細胞肺癌A549細胞株。體外上調(diào)非小細胞肺癌細胞中mi R-335表達可有效抑制胞的生長、降低細胞侵襲能力,并且促進細胞的凋亡。動物實驗表明mi R-335高表達能有效抑制裸鼠移植瘤生長。3.mi R-335是通過作用于靶基因Sp1和Bcl-w mRNA 3’UTR區(qū)對其進行轉錄后負調(diào)控,從而發(fā)揮相應的生物學功能。4.mi R-335發(fā)揮抑癌作用,有望成為非小細胞肺癌基因治療新的靶點。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：2441249