發(fā)布時(shí)間：2019-03-16 11:28

【摘要】：背景和目的 肺癌是世界上致死率最高的癌癥,可分為小細(xì)胞肺癌(SCLCs)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLCs)兩類,其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%。肺癌預(yù)后極差,一般來(lái)說(shuō)5年生存率大約為15%�；虬邢蛑委熞呀�(jīng)成為新的肺癌治療方向,了解肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)新的治療靶點(diǎn)以用于肺癌的診斷和治療,對(duì)我們?cè)缛展タ四[瘤有的重要意義。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是在真核細(xì)胞中廣泛存在非編碼單鏈RNA,長(zhǎng)度大約22個(gè)核苷酸,mi RNA能夠通過(guò)和靶基因m RNA的3’UTR區(qū)堿基配對(duì)從而參與基因轉(zhuǎn)錄后的水平調(diào)控,對(duì)生物體的生長(zhǎng)、分化、增值、凋亡等發(fā)揮調(diào)控作用。mi RNA表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生,目前關(guān)于mi RNA和腫瘤相關(guān)性的研究成為眾多科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)之一,mi RNA可能成為腫瘤診斷、治療以及預(yù)后判斷新的靶點(diǎn)。mi R-335定位于人染色體7q32.2處,在正常組織中廣范表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中扮演著復(fù)雜的角色。在胃癌、乳腺癌中mi R-335呈現(xiàn)低表達(dá),高表達(dá)mi R-335可以導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低。而在星型細(xì)胞瘤中剛發(fā)現(xiàn)mi R-335高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作。因而mi R-335的不同作用可能具有組織特異性,目前關(guān)于mi R-335在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生物學(xué)作用及調(diào)控的分子機(jī)制仍然不是很清楚。本課題計(jì)劃包含以下三部分:第一部分:非小細(xì)胞肺癌組織中mi R-335和Sp1、Bcl-w表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析;第二部分:上調(diào)mi R-335表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549生物學(xué)作用的影響;第三部分:mi R-335對(duì)Sp1、Bcl-W轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用機(jī)制的初步研究。第一部分非小細(xì)胞肺癌組織中mi R-335和Sp1、Bcl-w表達(dá)及與臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析方法： 1.收集手術(shù)切除的72例非小細(xì)胞肺癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本。2.采用Agilent mi RNA芯片檢測(cè)3例非小細(xì)胞肺癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本中mi RNA表達(dá)情況,分析差異化表達(dá)的mi RNA。3.運(yùn)用q RT-PCR檢測(cè)72例樣本中miR-335和Sp1、Bcl-w mRNA表達(dá),Spearman相關(guān)分析mi R-335表達(dá)與Sp1/Bcl-w m RNA表達(dá)的相關(guān)性。4.Western-blot檢測(cè)Sp1和Bcl-w蛋白表達(dá)5.分析mi R-335和Sp1、Bcl-w mRNA的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌病人性別,年齡、腫瘤分化、TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。6.應(yīng)用SPSS18.0.軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)а=0.05。結(jié)果： 1.Agilent mi RNA芯片檢測(cè)分析顯示共有56個(gè)mi RNAs在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)異常,其中26個(gè)mi RNAs表達(dá)上調(diào),30個(gè)mi RNAs表達(dá)下調(diào)。mi R-335在非小細(xì)胞肺癌中呈低表達(dá)(P0.05)。2.q RT-PCR檢測(cè)顯示在非小細(xì)胞肺癌組織中,mi R-335表達(dá)水平較正常組織顯著降低(P0.05),其表達(dá)水平和Sp1、Bcl-w的m RNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(R2分別為0.5231和0.6375)。3.非小細(xì)胞肺癌組織中mi R-335的表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度以及TNM分期有關(guān)(P0.05)。第二部分上調(diào)mi R-335表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549生物學(xué)作用的影響方法：1.合成mi R-335前體序列,在其兩端引入XhoⅠ和Eco RⅠ酶切位點(diǎn),將其克隆到慢病毒載體p GV中,構(gòu)建慢病毒載體p GV-mi R-335。2.將p GV-mi R-335、p Helper 1.0、p Helper 2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至慢病毒包裝細(xì)胞HEK-293T中,包裝產(chǎn)生慢病毒并測(cè)定滴度。3.慢病毒感染A549細(xì)胞,篩選得到穩(wěn)定感染的細(xì)胞株,q RT-PCR檢測(cè)慢病毒感染后A549細(xì)胞中mi R-335表達(dá)。4.將細(xì)胞分為三組:實(shí)驗(yàn)組(重組mi R-335慢病毒感染細(xì)胞),無(wú)關(guān)對(duì)照組(mi R-NC慢病毒感染細(xì)胞);空白組(未感染A549細(xì)胞)。5.CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)能力。6.AnncxinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色、Caspase-3檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。7.Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力8.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-335過(guò)表達(dá)對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響。結(jié)果： 1.經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序表明成功構(gòu)建了含有mi R-335的慢病毒載體,其感染A549細(xì)胞后mi R-335的相對(duì)表達(dá)量較空白細(xì)胞組和無(wú)關(guān)對(duì)照組顯著升高(P0.01)。2.CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示mi R-335組細(xì)胞較無(wú)關(guān)對(duì)照組以及空白對(duì)照組吸光度顯著減少。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mi R-335組細(xì)胞克隆形成數(shù)較空白對(duì)照組細(xì)胞和無(wú)關(guān)對(duì)照組著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.Anncxin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色檢測(cè)顯示重組mi R-335慢病毒感染后A549細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)對(duì)照組顯著升高,Caspase-3細(xì)胞活性較空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)為(20.7±2.6)個(gè),較空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)對(duì)照組顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示重組mi R-335慢病毒感染A549細(xì)胞后,實(shí)驗(yàn)組劃痕48h后劃痕愈合速度明顯慢于空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)組瘤塊體積較正常對(duì)照組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第三部分mi R-335對(duì)SP-1、Bcl-W轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用機(jī)制的初步研究方法： 1.通過(guò)生物信息學(xué)分析推測(cè)mi R-335的候選靶基因。2.構(gòu)建重組載體pmirGLO-w-Sp1、pmir GLO-mut-Sp1、pmir GLO-w-Bcl-w、pmir GLO-mut-Bcl-w。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mi R-335的靶基因。3.構(gòu)建表達(dá)載體pc DNA3.1-Sp1、pc DNA3.1-Bcl-w,通過(guò)回復(fù)實(shí)驗(yàn)分析mi R-335對(duì)A549生物學(xué)活性的調(diào)控。4.設(shè)計(jì)靶向Sp1和Bcl-w的si RNA序列,轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。分為以下5組:未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞(Blank組)、mi R-335慢病毒感染的A549細(xì)胞(mi R-335組)、Sp1 si RNA干擾表達(dá)的A549細(xì)胞(SP↓組),Bcl-w si RNA干擾表達(dá)的A549細(xì)胞(Bcl-w↓組),Sp1 si RNA和Bcl-w同時(shí)干擾表達(dá)的A549細(xì)胞(SP↓Bcl-w↓組)。q RT-PCR、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Sp1/Bcl-w m RNA和蛋白表達(dá),CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖,Anncxin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組凋亡,Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組侵襲能力的變化結(jié)果： 1.生物信息學(xué)分析推測(cè)Sp1、Bcl-w為mi R-335靶基因。2.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示mi R-335可以與Sp1、Bcl-w的3'UTR區(qū)結(jié)合,對(duì)其表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用。3.將不含Sp1和Bcl-w3'UTR區(qū)的重組載體pcDNA3.1-Sp1、pcDNA3.1-Bcl-w轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞后,可以回復(fù)mi R-335對(duì)Sp1和Bcl-w蛋白表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用,同時(shí)回復(fù)了mi R-335抑制A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。4.過(guò)表達(dá)mi R-335在A549細(xì)胞中可以起到和Sp1和Bcl-w si RNA相似的生物學(xué)效應(yīng),且較si RNA干擾能更有效的抑制A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。結(jié)論： 1.共有56個(gè)mi RNAs在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)異常,其中26個(gè)mi RNAs表達(dá)上調(diào),30個(gè)mi RNAs表達(dá)下調(diào)。在非小細(xì)胞肺癌組織中,mi R-335表達(dá)水平較正常組織顯著降低。其表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度以及TNM分期有關(guān)。2.成功建立了高表達(dá)mi R-335的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株。體外上調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中mi R-335表達(dá)可有效抑制胞的生長(zhǎng)、降低細(xì)胞侵襲能力,并且促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明mi R-335高表達(dá)能有效抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。3.mi R-335是通過(guò)作用于靶基因Sp1和Bcl-w mRNA 3’UTR區(qū)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控,從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。4.mi R-335發(fā)揮抑癌作用,有望成為非小細(xì)胞肺癌基因治療新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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