【摘要】：目的通過檢測分析DKK-3在胃腺癌中的表達量及其啟動子區(qū)甲基化狀況,探索研究其在影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的進程中可能的作用機制。通過對人類胃腺癌細胞和人類正常胃粘膜的細胞系進行細胞培養(yǎng),以獲取充足的胃癌腫瘤細胞。明確胃癌細胞中DKK-3的表達水平,并應(yīng)用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)檢測技術(shù),對胃癌細胞中DKK-3基因啟動子區(qū)的甲基化狀況進行檢測分析。通過對DKK-3下游相關(guān)凋亡蛋白表達水平差異的檢測分析,驗證其腫瘤抑制機制,并在動物實驗中進行驗證,總結(jié)分析DKK-3在胃癌疾病進程中表達減低或沉默的原因,并探究其抑制胃癌進展的作用機理。方法收集并納入158例胃腺癌蠟塊病理樣本及76例胃腺癌新鮮組織病理樣本,分別通過免疫組化、PCR及Western Blot技術(shù)分析檢測DKK-3在胃癌及癌旁組織中表達水平的差異。在幾種常見胃癌細胞系及正常胃粘膜細胞系中應(yīng)用RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測DKK-3在細胞及組織樣本中的表達情況。并在細胞實驗中應(yīng)用MSP檢測DKK-3基因啟動子區(qū)甲基化表達水平,并在病理組織樣本中進一步驗證其表達。選擇人胃癌BGC-823和SGC-7901細胞系培養(yǎng),并通過甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-dC處理癌細胞后,分組觀察細胞生長變化,分別應(yīng)用PCR及Western Blot檢測DKK-3表達水平的差異,通過MSP檢測兩組胃癌細胞在應(yīng)用5-Aza-dC處理前后的DKK-3表達水平的差異。選擇BGC-823細胞采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法使DKK-3穩(wěn)定高表達,分組觀察細胞的生長變化,通過Western Blot驗證轉(zhuǎn)染效果后,采用細胞生長測試手段(MTT)及流式細胞分析(FCM,flow cytometry)技術(shù)分組檢測轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡的變化情況。通過對人類BGC-823和SGC-7901胃癌細胞分組進行轉(zhuǎn)染使DKK-3過表達后,應(yīng)用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染前后在c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)通路中磷酸化的JNK、Caspase-3及PARP表達水平的改變。對轉(zhuǎn)染前后的BGC-823細胞應(yīng)用廣譜JNK抑制劑SP600125進行分組干預(yù)后,應(yīng)用FCM檢測分析細胞凋亡水平的改變。并應(yīng)用Western Blot對轉(zhuǎn)染前、后及SP600125處理后,磷酸化的JNK、Caspase-3及PARP表達量的差異分組進行驗證。最后,將過表達DKK-3的人胃癌BGC-823細胞分組接種到裸鼠體內(nèi),觀察種植瘤的生長情況,通過對種植瘤組織樣本IHC檢測,分析DKK-3在體內(nèi)的表達率的差異,同時應(yīng)用TUNEL技術(shù)檢測裸鼠體內(nèi)胃癌凋亡水平的變化情況。結(jié)果1.分別對158例人胃癌及癌旁的蠟塊組織樣本進行成組匹配IHC及76例人胃癌及癌旁新鮮組織樣本進行PCR及Western Blot檢測,發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的DKK-3比其癌旁及正常組織中的陽性檢出率更低,并發(fā)現(xiàn)隨著胃癌組織分化程度由低到高,DKK-3的表達水平也逐步增高,提示DKK-3在胃癌組織中表達水平的減低是其發(fā)揮抑癌作用的表現(xiàn)。2.通過實時熒光定量核酸擴增檢測qPCR、PCR及Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),DKK-3在正常人胃粘膜細胞中的表達水平要高于人胃癌細胞。通過對76例人胃癌及癌旁新鮮組織樣本分組進行MS-PCR檢測發(fā)現(xiàn),被檢測到出現(xiàn)異常甲基化現(xiàn)象的胃癌組織樣本要明顯多于癌旁及正常胃組織樣本。并發(fā)現(xiàn)隨著胃癌組織分化程度由高到低,DKK-3的甲基化程度也逐漸增高,提示DKK-3基因啟動子區(qū)的異常甲基化是引發(fā)DKK-3功能缺失并最終導(dǎo)致胃癌惡性進展的重要因素。接著通過MSP檢測證實在胃癌細胞中也發(fā)生了基因啟動子區(qū)甲基化現(xiàn)象,其甲基化程度比正常胃粘膜細胞高。使用甲基化酶抑制劑5-Aza-dC對胃癌細胞進行處理后,RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)DKK-3的表達水平較前恢復(fù)提高,兩組胃癌細胞均由之前的完全甲基化變?yōu)椴糠旨谆＿M一步提示,在胃癌中DKK-3基因啟動子的異常甲基化是其腫瘤抑制功能喪失的重要原因。3.選擇人胃癌BGC-823細胞進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達DKK-3后,再應(yīng)用MTT及FCM對其檢測發(fā)現(xiàn),胃癌細胞的凋亡水平較對照組顯著增高。通過Western Blot分組檢測過表達DKK-3后的兩種胃癌細胞中P-JNK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的表達量后發(fā)現(xiàn),上述蛋白的表達水平都較對照組增高。而在應(yīng)用JNK抑制劑SP600125對經(jīng)過轉(zhuǎn)染的BGC-823進行干預(yù)處理,再通過FCM檢測發(fā)現(xiàn)SP600125干預(yù)后的細胞凋亡相比過表達組有所減少,但仍較對照組高。繼續(xù)在BGC-823細胞系中應(yīng)用Western Blot對轉(zhuǎn)染前、后及SP600125處理后P-JNK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的含量分組檢測,發(fā)現(xiàn)由SP600125處理組的表達量較轉(zhuǎn)染組減少,提示凋亡較前減少,但較對照組仍偏高。4.把過表達DKK-3前后的人胃癌BGC-823細胞分組接種到裸鼠體內(nèi),觀察種植瘤生長變化,發(fā)現(xiàn)過表達DKK-3組種植瘤成長速度明顯比較慢,腫瘤大小亦明顯較小。取種植瘤組織樣本進行IHC檢測發(fā)現(xiàn),過表達組的DKK-3陽性率比對照組顯著增高,應(yīng)用TUNEL檢測其結(jié)果提示,過表達DKK-3組的異體種植瘤中的腫瘤細胞凋亡水平較對照組顯著增高。結(jié)論DKK-3基因的表達缺失及基因啟動子區(qū)甲基化是胃癌中的常見事件,并且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān);發(fā)生DKK-3表達缺失或減低的胃癌患者普遍都有一個顯著縮短的存活期;DKK-3可以作為評估胃癌預(yù)后不良的獨立預(yù)測標志物。DKK-3基因啟動子異常甲基化的發(fā)生是其抑癌作用喪失的重要原因。DKK-3可以是通過激活JNK介導(dǎo)的細胞凋亡通路使胃癌細胞的凋亡增多,最終發(fā)揮其抑制胃癌進展的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉安,譚升順,張江安,馮義國,任小蓉,雷小兵,文京華;胃癌皮膚轉(zhuǎn)移1例[J];臨床皮膚科雜志;2003年12期

2 龍文;;胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)19例臨床研究[J];現(xiàn)代診斷與治療;2013年02期

3 呂承福;一例胃癌晚期患者因意外傷害而痊愈的啟示[J];針灸臨床雜志;1996年04期

4 王璦萍,田衛(wèi)衛(wèi);胃癌并心包轉(zhuǎn)移1例[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2000年13期

5 王健,鄒義壯,唐麗麗,李杰,張東,金山,劉娟;胃癌患者的生存期與個性特征、應(yīng)付方式及免疫功能的相關(guān)性研究[J];中華精神科雜志;2001年03期

6 王博文,楊波,趙淑琴;青年胃癌33例臨床分析[J];寧夏醫(yī)學(xué)雜志;2002年10期

7 劉步珍,張海芳;以胃外表現(xiàn)為首發(fā)癥狀的胃癌26例誤診分析[J];山東醫(yī)藥;2003年18期

8 任剛,蔡嶸,陳強,許幼如,程普選,陳惠芳;女性胃癌[J];上海醫(yī)學(xué);2003年03期

9 王盛根,王壽九,吳楠,潘桂紅,焦霞;母子同時患胃癌報告[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2004年01期

10 徐開,陳連珠;1例胃癌晚期術(shù)后使用苦草治療[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2004年24期

相關(guān)會議論文 前4條

1 張恩寧;;胃癌[A];山東省第四屆“CSCO——山東”首屆腫瘤化療學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2009年

2 徐智民;周丹;張萬岱;何燕萍;智發(fā)朝;朱建新;王莉慧;肖冰;潘德壽;宋姍;趙永玲;;幽門螺桿菌感染及其免疫型與胃癌的關(guān)系研究[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會第十四次全國消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2002年

3 魏品康;;胃癌非手術(shù)療法治療研究與策略[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會第十六次全國消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2004年

4 郭新海;毛芙敏;吳旭輝;許敬;凌志強;李繼承;;舟山海島地區(qū)胃癌D17S396基因遺傳不穩(wěn)定性與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移[A];2009年浙江省腫瘤學(xué)術(shù)年會暨腫瘤診治新進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 天津市腫瘤醫(yī)院 梁寒;五類人警惕胃癌[N];大眾衛(wèi)生報;2007年

2 本報記者 項煜虹;胃癌正襲向習(xí)慣不良的年輕人群[N];大眾科技報;2008年

3 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院胃部腫瘤科教授 梁寒　整理 李運紅 胡顏;胃癌盯上中堅力量[N];健康報;2008年

4 本報記者 劉學(xué)美;警惕胃癌[N];中國消費者報;2000年

5 ;胃癌晚期能活多久[N];大眾衛(wèi)生報;2010年

6 本報記者　朱勤;三代教授破解“莊河之謎”[N];遼寧日報;2006年

7 ;胃癌:隱蔽的殺手[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2005年

8 健康時報記者 劉永曉　特約記者 施敏;胃癌新晉青年殺手[N];健康時報;2011年

9 趙迎 任勇;胃癌襲向年輕人[N];天津日報;2006年

10 北京天壇醫(yī)院外科主任 宋茂民;預(yù)防胃癌牢記九點[N];大眾衛(wèi)生報;2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 宋國棟;DKK-3在胃癌進展中作用機制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

2 秦云植;NQO1及其抑制劑在胃癌預(yù)后評估及靶向治療中的作用研究[D];延邊大學(xué);2015年

3 石s，

本文編號：2440178