【摘要】：目的通過檢測(cè)分析DKK-3在胃腺癌中的表達(dá)量及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況,探索研究其在影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程中可能的作用機(jī)制。通過對(duì)人類胃腺癌細(xì)胞和人類正常胃粘膜的細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),以獲取充足的胃癌腫瘤細(xì)胞。明確胃癌細(xì)胞中DKK-3的表達(dá)水平,并應(yīng)用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)檢測(cè)技術(shù),對(duì)胃癌細(xì)胞中DKK-3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀況進(jìn)行檢測(cè)分析。通過對(duì)DKK-3下游相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平差異的檢測(cè)分析,驗(yàn)證其腫瘤抑制機(jī)制,并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證,總結(jié)分析DKK-3在胃癌疾病進(jìn)程中表達(dá)減低或沉默的原因,并探究其抑制胃癌進(jìn)展的作用機(jī)理。方法收集并納入158例胃腺癌蠟塊病理樣本及76例胃腺癌新鮮組織病理樣本,分別通過免疫組化、PCR及Western Blot技術(shù)分析檢測(cè)DKK-3在胃癌及癌旁組織中表達(dá)水平的差異。在幾種常見胃癌細(xì)胞系及正常胃粘膜細(xì)胞系中應(yīng)用RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)DKK-3在細(xì)胞及組織樣本中的表達(dá)情況。并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用MSP檢測(cè)DKK-3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化表達(dá)水平,并在病理組織樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)。選擇人胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞系培養(yǎng),并通過甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-AZA-dC處理癌細(xì)胞后,分組觀察細(xì)胞生長變化,分別應(yīng)用PCR及Western Blot檢測(cè)DKK-3表達(dá)水平的差異,通過MSP檢測(cè)兩組胃癌細(xì)胞在應(yīng)用5-Aza-dC處理前后的DKK-3表達(dá)水平的差異。選擇BGC-823細(xì)胞采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法使DKK-3穩(wěn)定高表達(dá),分組觀察細(xì)胞的生長變化,通過Western Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后,采用細(xì)胞生長測(cè)試手段(MTT)及流式細(xì)胞分析(FCM,flow cytometry)技術(shù)分組檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡的變化情況。通過對(duì)人類BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染使DKK-3過表達(dá)后,應(yīng)用Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后在c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)通路中磷酸化的JNK、Caspase-3及PARP表達(dá)水平的改變。對(duì)轉(zhuǎn)染前后的BGC-823細(xì)胞應(yīng)用廣譜JNK抑制劑SP600125進(jìn)行分組干預(yù)后,應(yīng)用FCM檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡水平的改變。并應(yīng)用Western Blot對(duì)轉(zhuǎn)染前、后及SP600125處理后,磷酸化的JNK、Caspase-3及PARP表達(dá)量的差異分組進(jìn)行驗(yàn)證。最后,將過表達(dá)DKK-3的人胃癌BGC-823細(xì)胞分組接種到裸鼠體內(nèi),觀察種植瘤的生長情況,通過對(duì)種植瘤組織樣本IHC檢測(cè),分析DKK-3在體內(nèi)的表達(dá)率的差異,同時(shí)應(yīng)用TUNEL技術(shù)檢測(cè)裸鼠體內(nèi)胃癌凋亡水平的變化情況。結(jié)果1.分別對(duì)158例人胃癌及癌旁的蠟塊組織樣本進(jìn)行成組匹配IHC及76例人胃癌及癌旁新鮮組織樣本進(jìn)行PCR及Western Blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的DKK-3比其癌旁及正常組織中的陽性檢出率更低,并發(fā)現(xiàn)隨著胃癌組織分化程度由低到高,DKK-3的表達(dá)水平也逐步增高,提示DKK-3在胃癌組織中表達(dá)水平的減低是其發(fā)揮抑癌作用的表現(xiàn)。2.通過實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)qPCR、PCR及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),DKK-3在正常人胃粘膜細(xì)胞中的表達(dá)水平要高于人胃癌細(xì)胞。通過對(duì)76例人胃癌及癌旁新鮮組織樣本分組進(jìn)行MS-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),被檢測(cè)到出現(xiàn)異常甲基化現(xiàn)象的胃癌組織樣本要明顯多于癌旁及正常胃組織樣本。并發(fā)現(xiàn)隨著胃癌組織分化程度由高到低,DKK-3的甲基化程度也逐漸增高,提示DKK-3基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化是引發(fā)DKK-3功能缺失并最終導(dǎo)致胃癌惡性進(jìn)展的重要因素。接著通過MSP檢測(cè)證實(shí)在胃癌細(xì)胞中也發(fā)生了基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化現(xiàn)象,其甲基化程度比正常胃粘膜細(xì)胞高。使用甲基化酶抑制劑5-Aza-dC對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行處理后,RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DKK-3的表達(dá)水平較前恢復(fù)提高,兩組胃癌細(xì)胞均由之前的完全甲基化變?yōu)椴糠旨谆�。進(jìn)一步提示,在胃癌中DKK-3基因啟動(dòng)子的異常甲基化是其腫瘤抑制功能喪失的重要原因。3.選擇人胃癌BGC-823細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)DKK-3后,再應(yīng)用MTT及FCM對(duì)其檢測(cè)發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞的凋亡水平較對(duì)照組顯著增高。通過Western Blot分組檢測(cè)過表達(dá)DKK-3后的兩種胃癌細(xì)胞中P-JNK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn),上述蛋白的表達(dá)水平都較對(duì)照組增高。而在應(yīng)用JNK抑制劑SP600125對(duì)經(jīng)過轉(zhuǎn)染的BGC-823進(jìn)行干預(yù)處理,再通過FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SP600125干預(yù)后的細(xì)胞凋亡相比過表達(dá)組有所減少,但仍較對(duì)照組高。繼續(xù)在BGC-823細(xì)胞系中應(yīng)用Western Blot對(duì)轉(zhuǎn)染前、后及SP600125處理后P-JNK、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP的含量分組檢測(cè),發(fā)現(xiàn)由SP600125處理組的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染組減少,提示凋亡較前減少,但較對(duì)照組仍偏高。4.把過表達(dá)DKK-3前后的人胃癌BGC-823細(xì)胞分組接種到裸鼠體內(nèi),觀察種植瘤生長變化,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DKK-3組種植瘤成長速度明顯比較慢,腫瘤大小亦明顯較小。取種植瘤組織樣本進(jìn)行IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)組的DKK-3陽性率比對(duì)照組顯著增高,應(yīng)用TUNEL檢測(cè)其結(jié)果提示,過表達(dá)DKK-3組的異體種植瘤中的腫瘤細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組顯著增高。結(jié)論DKK-3基因的表達(dá)缺失及基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是胃癌中的常見事件,并且與腫瘤的惡性程度及預(yù)后密切相關(guān);發(fā)生DKK-3表達(dá)缺失或減低的胃癌患者普遍都有一個(gè)顯著縮短的存活期;DKK-3可以作為評(píng)估胃癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)標(biāo)志物。DKK-3基因啟動(dòng)子異常甲基化的發(fā)生是其抑癌作用喪失的重要原因。DKK-3可以是通過激活JNK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路使胃癌細(xì)胞的凋亡增多,最終發(fā)揮其抑制胃癌進(jìn)展的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2440178