【摘要】：研究背景在2012年CDC (Centersfor Disease Control)腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中,乳腺癌的發(fā)病率,已成為僅次于肺癌的第二位,并且在死亡率中排第五位。而在女性人群中,乳腺癌是患病率以及死亡率均最高的惡性腫瘤。而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生,包括肺、骨骼及腦內(nèi)轉(zhuǎn)移,成為乳腺癌患者致死的主要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在一些因素的作用下,失去極性及細(xì)胞間緊密連接和黏附連接,獲得了浸潤(rùn)性和游走遷移能力,變成具備間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的細(xì)胞的過(guò)程,不僅在胚胎發(fā)育中起到了重要作用,現(xiàn)在的理論認(rèn)為,EMT過(guò)程在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中,尤其是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,起到了重要的作用。因此,深入的研究了解EMT過(guò)程,可更進(jìn)一步的了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的模式,為乳腺癌治療及減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供一種可行思路。而目前的關(guān)于EMT過(guò)程在腫瘤內(nèi)的作用都是來(lái)源于腫瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)或是離體腫瘤切片的分子生物學(xué)檢測(cè),缺乏直接的活體研究數(shù)據(jù),對(duì)于認(rèn)識(shí)EMT過(guò)程的活體特征仍然十分欠缺�；谝陨系难芯勘尘�,本課題擬采用EMT驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型,結(jié)合雙光子顯微鏡活體成像,同時(shí)探索離體腫瘤及活體原位乳腺癌內(nèi)EMT過(guò)程相關(guān)的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)及功能學(xué)變化,同時(shí),利用此模型及成像方法,探索抗腫瘤藥物對(duì)EMT過(guò)程影響的活體特點(diǎn),為EMT過(guò)程在原位乳腺癌內(nèi)的存在以及活體細(xì)胞學(xué)特征提供直接的影像學(xué)證據(jù),并為抗腫瘤藥物對(duì)EMT過(guò)程的影響提供直接的影像學(xué)監(jiān)測(cè)方法,為進(jìn)一步乳腺癌治療的研究提供新的思路。研究方法第一部分 EMT介導(dǎo)的熒光轉(zhuǎn)變指示乳腺癌小鼠模型的構(gòu)建及鑒定本課題采用EMT驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型,小鼠體內(nèi)攜帶MMTV-PyMT、Fsp1-Cre以及Rosa26Loxp-RFP-GFP報(bào)告基因,獲取轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)原位乳腺癌,消化獲得原代乳腺癌細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選,獲得純RFP陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基免疫細(xì)胞染色,驗(yàn)證RFP-GFP熒光蛋白轉(zhuǎn)變與細(xì)胞上皮-間質(zhì)表型變化之間的關(guān)系,驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型的可行性。將篩選的RFP陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞種植于SCID小鼠乳腺脂肪墊內(nèi),形成原位乳腺癌,利用在體皮瓣成形術(shù)暴露原位腫瘤,進(jìn)行雙光子顯微鏡成像,來(lái)驗(yàn)證雙光子纖維性活體乳腺癌模型成像的可行性。第二部分離體細(xì)胞EMT過(guò)程的影像學(xué)特征及小鼠原位乳腺癌內(nèi)EMT過(guò)程活體細(xì)胞學(xué)特性研究利用篩選的純RFP陽(yáng)性細(xì)胞,經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng),并利用細(xì)胞連續(xù)成像設(shè)備進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像,觀測(cè)離體細(xì)胞EMT過(guò)程發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)及形態(tài)學(xué)變化,來(lái)呈現(xiàn)離體腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生的過(guò)程。利用雙光子顯微鏡小鼠原位乳腺癌活體成像,經(jīng)同視野連續(xù)動(dòng)態(tài)成像,獲取在體原位腫瘤內(nèi)EMT過(guò)程發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)及形態(tài)學(xué)變化,獲取活體腫瘤內(nèi)EMT過(guò)程發(fā)生過(guò)程的影像學(xué)資料。分析活體成像所獲得的EMT后GFP陽(yáng)性細(xì)胞的與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及運(yùn)動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù),并利用腫瘤切片的全切片成像,分析EMT發(fā)生在腫瘤內(nèi)的分布特征,綜合分析EMT后腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及侵襲遷移所起的作用。第三部分抗腫瘤藥物對(duì)原位乳腺癌內(nèi)EMT過(guò)程影響的活體影像學(xué)研究經(jīng)乳腺癌患者腫瘤基因數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選,選定c-Met靶向藥物卡博替尼(Cabozantinib,XL-184)作為抗腫瘤藥物,首先在離體篩選的腫瘤細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證藥物對(duì)體外TGF-β所誘導(dǎo)的EMT過(guò)程的影響。經(jīng)藥物處理的小鼠,首先觀察藥物對(duì)原位乳腺癌生長(zhǎng)速度的影響,藥物處理后,經(jīng)雙光子顯微鏡原位腫瘤活體成像,觀察腫瘤內(nèi)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的分布特點(diǎn)、細(xì)胞學(xué)形態(tài)特點(diǎn),與對(duì)照組比較,分析藥物處理對(duì)原位腫瘤內(nèi)EMT過(guò)程的影響,并利用腫瘤切片免疫染色驗(yàn)證其細(xì)胞表型變化。研究結(jié)果1.經(jīng)過(guò)原代分離的腫瘤細(xì)胞,經(jīng)過(guò)篩選、培養(yǎng),并利用上皮表型表面標(biāo)志物E-cadherin進(jìn)行免疫染色,結(jié)果證實(shí)當(dāng)腫瘤細(xì)胞由RFP陽(yáng)性轉(zhuǎn)變?yōu)镚FP陽(yáng)性時(shí),腫瘤細(xì)胞發(fā)生了 EMT過(guò)程,失去了上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物,向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變,證實(shí)了此轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型可用熒光蛋白顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)標(biāo)識(shí)EMT過(guò)程的發(fā)生。在種植的小鼠原位乳腺癌活體雙光子顯微鏡成像中,原位腫瘤內(nèi)可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的散在分布,證實(shí)雙光子顯微鏡可用于原位腫瘤內(nèi)EMT過(guò)程的活體成像。2.經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)動(dòng)態(tài)成像,獲得了腫瘤細(xì)胞由原先無(wú)GFP表達(dá)至GFP強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的過(guò)程,并且在此過(guò)程中,腫瘤細(xì)胞形態(tài)逐漸向長(zhǎng)梭形發(fā)生改變,并且類(lèi)似的過(guò)程在原位乳腺癌活體成像中也被獲取到,即離體及在體腫瘤內(nèi)EMT過(guò)程的影像學(xué)變化被成功獲取。3. EMT后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表示,腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后,絕大部分細(xì)胞(96.55%)變?yōu)榫哂羞w移侵襲表征的細(xì)胞學(xué)形態(tài),而僅有少部分(3.45%)細(xì)胞變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞參與腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展的調(diào)節(jié)。并且經(jīng)EMT,腫瘤細(xì)胞獲得了更多的侵襲相關(guān)形態(tài)學(xué)特征,呈長(zhǎng)梭形、具有更多細(xì)胞膜突起,在腫瘤小葉內(nèi)移動(dòng)較緩慢,而在血管間隙邊緣時(shí)移動(dòng)加速,且血管間隙邊緣細(xì)胞移動(dòng)呈簇狀,形成"cell streaming"。4.在離體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)下,藥物XL-184逆轉(zhuǎn)了 TGF-β所誘導(dǎo)的EMT過(guò)程,而在活體原位乳腺癌中,XL-184抑制了腫瘤的生長(zhǎng),活體雙光子顯微鏡成像可見(jiàn)腫瘤內(nèi)呈簇狀分布的GFP陽(yáng)性細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)類(lèi)似于周邊RFP陽(yáng)性上皮表型細(xì)胞,經(jīng)免疫染色證實(shí)簇狀GFP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)E-cadherin,為上皮表型細(xì)胞。結(jié)論EMT驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌模型結(jié)合雙光子顯微鏡活體成像,成功地進(jìn)行了原位乳腺癌內(nèi)EMT過(guò)程的活體成像,并且獲得了離體細(xì)胞及活體原位乳腺癌內(nèi)細(xì)胞水平EMT過(guò)程的直接影像學(xué)證據(jù)。經(jīng)過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析,可見(jiàn)EMT過(guò)程后,腫瘤細(xì)胞主要表現(xiàn)為具有遷移侵襲表征的細(xì)胞學(xué)形態(tài),證實(shí)了 EMT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用的理論。離體腫瘤細(xì)胞藥物處理,證實(shí)了抗腫瘤藥物可抑制EMT過(guò)程,而活體成像數(shù)據(jù)證實(shí),抗腫瘤藥物可在EMT過(guò)程發(fā)生的早期終止逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生,因此藥物抑制乳腺癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移部分是通過(guò)抑制EMT過(guò)程實(shí)現(xiàn)的,為乳腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9

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