發(fā)布時間：2019-03-11 15:44

【摘要】：研究背景：甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,甲狀腺癌已成為近年來發(fā)病率增高最快的惡性腫瘤之一,且女性居多。甲狀腺癌可分為來源于甲狀腺濾皮上皮的甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺未分化癌和來源于濾泡旁C細胞的甲狀腺髓樣癌。其中,甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡狀癌被傳統(tǒng)定義為分化型甲狀腺癌,發(fā)病率在90%以上,不但病情進展緩慢,而且治療效果較好；甲狀腺未分化癌雖然發(fā)病率很低,但是死亡率極高,預(yù)后極差。在分化型甲狀腺癌中,存在部分患者分化程度偏低,或原本屬于高分化型甲狀腺癌的患者隨著病情進展及放射性131I治療次數(shù)增多使分化程度降低,其分化程度低于高分化型甲狀腺癌,但高于未分化型甲狀腺癌,被稱為低分化甲狀腺癌(PDTC)。高分化甲狀腺癌通過甲狀腺切除術(shù)、放射性131I治療及后續(xù)甲狀腺激素抑制治療,大部分患者臨床療效及遠期預(yù)后較好。然而,低分化型甲狀腺癌及未分化型甲狀腺癌患者對放射性131I治療反應(yīng)性較差,尤其未分化型甲狀腺癌患者幾乎不攝取放射性碘,這就使這部分患者的臨床療效及遠期預(yù)后不佳。如何提高低攝碘及不攝碘甲狀腺癌患者的攝碘率,對改善其臨床療效及遠期預(yù)后至關(guān)重要。在甲狀腺癌的發(fā)病過程中,某些基因發(fā)生突變或移位、甲基化等異常時,會通過激活相關(guān)的信號通路導(dǎo)致細胞異常增殖或者凋亡,導(dǎo)致癌變,常見的基因突變包括鈉碘同向轉(zhuǎn)運體(NIS)本身突變及BRAF、RAS、PTEN等調(diào)控NIS表達的基因突變,基因易位如RET/PTC、PAX8(配對盒基因8)/PPARγ(過氧化物酶增殖物激活受體γ)等各種基因轉(zhuǎn)錄或者表達異常,都有可能通過調(diào)控某些特定的細胞信號傳導(dǎo)通路,誘發(fā)細胞突變,從而導(dǎo)致細胞異常增殖或者凋亡,導(dǎo)致癌變。甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移與許多信號通路或相關(guān)基因表達有關(guān),比較重要的信號通路有促甲狀腺激素受體(TSHR)通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、Noth信號通路等,其他的信號通路還包括核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)、WNT-β-catenin、 JAK激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、STAT轉(zhuǎn)錄活化因子等。但關(guān)于甲狀腺癌細胞攝碘率降低的相關(guān)機制研究很少。放射性131I治療甲狀腺癌的基礎(chǔ)是甲狀腺癌細胞能夠攝取放射性碘。碘在甲狀腺細胞中轉(zhuǎn)運主要分為兩個步驟：首先,碘在NIS蛋白的介導(dǎo)下經(jīng)甲狀腺濾泡細胞基底膜逆電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi),然后,由兩種蛋白介導(dǎo),包括pendrin表達蛋白和人類頂膜碘轉(zhuǎn)運體(hAIT)蛋白,這兩種蛋白將碘從細胞頂端順電化學(xué)梯度運送入濾胞腔。在這個過程中,Na+/I+一三磷酸腺苷(ATP)酶作為能量供應(yīng)者,在Na+順化學(xué)梯度內(nèi)流時,將碘以Na+：I-為2：1的方式轉(zhuǎn)運進入甲狀腺細胞。NIS蛋白主要在靠近毛細血管的甲狀腺濾泡細胞基底膜上表達,在乳腺組織、卵巢、睪丸、腮腺、唾液腺、淚腺、頜下腺、腎上腺、胰腺、心臟和胸腺、直腸等器官中也有少量表達。目前人們認識到甲狀腺癌細胞攝碘能力存在缺陷,主要集中在兩個方面：一是NIS蛋白表達減少或缺失；二是NIS在細胞內(nèi)的定位障礙。促甲狀腺激素(TSH)是NIS表達的主要調(diào)控因子,另外,其轉(zhuǎn)錄因子也與NIS的調(diào)節(jié)有關(guān)。TSH、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1 (TTF-1)、PAX-8、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、β-連環(huán)蛋白、發(fā)狀分裂相關(guān)增強子-1(Hes-1)、固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白(SREBPs)、垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)、垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因結(jié)合因子(PBF)、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子1(FoxEl)等因子分別通過不同通路調(diào)節(jié)鈉碘同向轉(zhuǎn)運體基因啟動子(NIS_PP)和鈉碘同向轉(zhuǎn)運體上游增強子(NUE)的活性,促進或抑制NIS的表達及定位。NIS翻譯后的修飾,如磷酸化、糖基化等也參與其中。配對盒基因8(PAX8)是屬于細胞限制性轉(zhuǎn)錄因子,該蛋白最早在小鼠甲狀腺的發(fā)育過程出現(xiàn),隨后發(fā)現(xiàn)在甲狀腺濾泡狀癌中呈高度表達。PAX8不僅能夠調(diào)控甲狀腺球蛋白(Tg)、甲狀腺過氧化物酶(TPO)和促甲狀腺受體的基因啟動子,調(diào)節(jié)甲狀腺細胞的增殖和分化,而且還是調(diào)節(jié)NIS_PP和NUE活性的重要因子。NIS的表達受到TSH的調(diào)控且需要PAX8啟動NIS基因的啟動子。硼替佐米作為一種蛋白酶體抑制劑,在治療難治性或復(fù)發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、其它類型的漿細胞疾病以及某些實體腫瘤中具有令人矚目的療效。其中,硼替佐米治療多發(fā)性骨髓瘤的機制與抑制NF-κB有關(guān),在腫瘤細胞中,蛋白酶體26S亞基的活性被硼替佐米特異性抑制后,能夠明顯減少NF-κB抑制因子(IKB)的降解,IκB與NF-κB結(jié)合后能有效抑制NF-κB的活性,抑制與細胞增殖、分化相關(guān)的基因的表達,減少骨髓瘤相關(guān)粘附因子的表達和細胞生長因子的分泌,最終導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖減少和凋亡。已有研究證實,硼替佐米能夠延遲多種腫瘤細胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,并抑制新生血管的形成；不僅如此,硼替佐米還可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,以及改善骨髓瘤細胞對阿霉素、馬法蘭和地塞米松等藥物的耐藥性。Annette Altmann等在甲狀腺未分化癌中進行硼替佐米抗腫瘤研究時,發(fā)現(xiàn)硼替佐米處理后甲狀腺相關(guān)因子PAX8、 TTF-1等表達增加。然而,尚未有研究證實硼替佐米對甲狀腺癌的治療作用,故我們嘗試用硼替佐米處理各種類型甲狀腺癌細胞,以PAX8蛋白為切入點,觀察硼替佐米對PAX8蛋白的影響,繼而觀察調(diào)節(jié)PAX8蛋白表達對甲狀腺癌細胞攝碘率的影響,試圖為臨床低攝碘甚至不攝碘的甲狀腺癌患者的放射性131I治療尋找新的思路。目的：1.觀察不同類型的甲狀腺癌細胞中PAX8蛋白的表達差異。2.觀察硼替佐米處理后對各種類型甲狀腺癌細胞中PAX8蛋白表達的影響,探討硼替佐米在促甲狀腺癌分化中的作用。3.觀察不同類型甲狀腺癌細胞膜上NIS蛋白的表達差異。4.觀察硼替佐米處理后不同類型的甲狀腺癌細胞膜上NIS蛋白在細胞膜上的表達情況。5.檢測硼替佐米處理后的不同類型的甲狀腺癌細胞的細胞攝碘率是否改變,探討硼替佐咪是否有促進甲狀腺癌分化的效果,企圖為臨床甲狀腺癌放射性131I治療尋找新的思路。方法：1.細胞分組及培養(yǎng)：(1)接種細胞：用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞,接種于6孔板上,每孔3×105個細胞,每孔加入2m1上述完全培養(yǎng)基,充分混勻,在37°C、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)24小時,待細胞貼壁后換含低濃度(2%)血清培養(yǎng)基饑餓24小時；(2)配制含不同濃度硼替佐米的培養(yǎng)液：無菌RPMI 1640培養(yǎng)基,加10%胎牛血清、1%雙抗及2mM/L谷氨酰胺,含硼替佐米28ng/mL、56ng/mL、112ng/mL、 196ng/mL、280ng/mL,混勻；(3)用吸管吸掉舊的培養(yǎng)液,用PBS沖洗2遍,將細胞分別加入上述含不同濃度硼替佐米的培養(yǎng)液,在37°C、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng),培養(yǎng)時間分別為24小時、48小時；2.篩選硼替佐米作用的最佳濃度及時間：分別以濃度為28ng/mL、56ng/mL、112ng/mL、196ng/mL、280ng/mL的硼替佐米處理不同類型甲狀腺癌細胞24小時和48小時,CCK-8檢測硼替佐米處理后甲狀腺癌細胞活力,尋找最佳作用濃度和最佳作用時間進行后續(xù)實驗。3. Western blot技術(shù)檢測硼替佐米處理前后的不同類型甲狀腺癌細胞中PAX8蛋白表達情況。4. Western blot技術(shù)檢測硼替佐米處理前后的不同類型甲狀腺癌細胞中NIS蛋白在細胞膜上的表達情況。5.利用125I檢測各種甲狀腺癌細胞的攝碘率,判斷硼替佐米是否可以促進甲狀腺癌細胞的分化,提高細胞攝碘能力。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。以均數(shù)±標準差(mean±SEM)表示計量資料。采用student t檢驗(student's t test)進行兩組數(shù)據(jù)間的比較。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多實驗組間的比較。顯著性檢驗標準α=0.05,P0.05時認為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.硼替佐米處理不同類型甲狀腺癌細胞24小時后,檢測細胞活力,甲狀腺乳頭狀癌細胞B-CPAP:對照組(98%)、28ng/mL(94%)、56ng/mL(86%)、112ng/mL (80%)、196ng/mL(76%)、280ng/mL(69%),甲狀腺低分化癌細胞WRO 82-1:對照組(98.3%)、28ng/mL(94%)、56ng/mL (88%)、112ng/mL (84%)、 196ng/mL(77%)、280ng/mL(71%),甲狀腺未分化癌細胞ARO：對照組(99.7%)、28ng/mL (95%)、56ng/mL (89%)、112ng/mL (84%)、196ng/mL (78%)、 280ng/mL (74%);硼替佐米處理48小時后,檢測細胞活力,甲狀腺乳頭狀癌細胞B-CPAP:對照組(76%)、28ng/mL (71%)、56ng/mL (62%)、112ng/mL (48%)、196ng/mL(42%)、280ng/mL(36%),甲狀腺低分化癌細胞WRO 82-1：對照組(78.7%)、28ng/mL (74%)、56ng/mL (65%)、112ng/mL (53%)、 196ng/mL(44%)、280ng/mL(39%),甲狀腺未分化癌細胞ARO：對照組(81.7%)、28ng/mL (77%)、56ng/mL (68%)、112ng/mL (54%)、196ng/mL (47%)、 280ng/mL (43%)。IC50對應(yīng)濃度為112ng/mL,故篩選其為最佳實驗濃度進行后續(xù)實驗。硼替佐米處理48小時后各組細胞中細胞存活率差異較處理24小時后差異明顯,因此后續(xù)實驗選擇作用時間為48小時。2.未加硼替佐米處理細胞前,利用Western blot技術(shù)檢測正常甲狀腺細胞和各類型甲狀腺癌細胞中PAX8蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)在正常甲狀腺細胞中PAX8蛋白的表達最高,甲狀腺乳頭狀癌細胞表達次之,甲狀腺低分化癌細胞及甲狀腺未分化癌細胞中表達最低,且前者較后者表達高。3.濃度為112ng/mL的硼替佐米處理48小時后,Western blot技術(shù)檢測各類型甲狀腺癌細胞中PAX8蛋白表達,結(jié)果均較處理前明顯升高。4.未加硼替佐米處理細胞前,利用Western blot技術(shù)檢測正常甲狀腺細胞和各類型甲狀腺癌細胞膜上NIS蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)在正常甲狀腺細胞膜上NIS蛋白的表達最高,甲狀腺乳頭狀癌細胞膜表達次之,甲狀腺低分化癌細胞膜再次之,甲狀腺未分化癌細胞膜表達最低。5.濃度為112ng/mL的硼替佐米處理48小時后,Western blot技術(shù)檢測不同類型甲狀腺癌細胞中NIS蛋白在細胞膜上的表達,結(jié)果顯示沒有明顯提高。6.濃度為112 ng/mL的硼替佐米處理48小時后,利用125I檢測各種甲狀腺癌細胞的攝碘率,結(jié)果顯示各種甲狀腺癌細胞的攝碘率較對照組均沒有明顯提高。結(jié)論：1.在不同類型甲狀腺細胞中,PAX8蛋白的表達存在差異,其中在正常甲狀腺細胞中表達最高,甲狀腺乳頭狀癌細胞表達次之,甲狀腺低分化癌細胞及甲狀腺未分化癌細胞中表達最低,且前者較后者表達高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2.濃度為112ng/mL的硼替佐米處理不同類型甲狀腺癌細胞48小時后,PAX8蛋白的表達均較未處理組有所提高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.在不同類型甲狀腺細胞膜上,NIS蛋白的表達存在差異,其中在正常甲狀腺細胞膜上表達最高,甲狀腺乳頭狀癌細胞膜上表達次之,甲狀腺未分化癌細胞膜上表達最低,甲狀腺低分化癌細胞膜上表達較甲狀腺未分化癌細胞膜上表達高,但低于甲狀腺乳頭狀癌細胞膜上表達,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。4.濃度為112ng/mL的硼替佐米處理不同類型甲狀腺癌細胞48小時后,NIS蛋白表達沒有明顯影響。5.濃度為112ng/mL的硼替佐米處理不同類型甲狀腺癌細胞48小時前后,各類型甲狀腺癌細胞攝碘率未見明顯差異。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R736.1

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本文編號：2438408