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基于SELEX技術(shù)的特異熒光DNA酶篩選和機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間:2019-03-07 11:31
【摘要】:目前癌癥是世界上最致命的人類疾病之一。當(dāng)前,在世界范圍內(nèi)的所有癌癥當(dāng)中,乳腺癌是婦女當(dāng)中被診斷最多的,大約占所有癌癥的四分之一。而且隨著全球經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展以及隨著而來的西方生活方式的流行,發(fā)展中國家的乳腺癌發(fā)病率在持續(xù)上升。在醫(yī)學(xué)臨床研究中,不同階段的乳腺癌有相應(yīng)不同的臨床表現(xiàn)和治療方案。盡管目前已經(jīng)有一些早期診斷方法,諸如乳房X射線放射造影、核磁共振成像等,然而在發(fā)展中國家,大部分的乳腺癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于乳腺癌發(fā)展后期。這是因?yàn)檫@些傳統(tǒng)的方法具有價(jià)格昂貴、檢測設(shè)備依賴度較高、以及檢查過程繁瑣等缺點(diǎn)。因此開發(fā)一種簡易并且快捷的乳腺癌檢測手段對于提高乳腺癌患者的生存率是非常有意義的。所以利用乳腺癌細(xì)胞外分泌混合物建立的體外血清檢測無疑是最好的方法;谶@種需要,我們嘗試開發(fā)一種新型的乳腺癌檢測方法,其主要依賴具有催化活性的單鏈脫氧核糖核苷酸分子(DNAzyme)或者稱之為適配子。利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX),這種催化DNA分子能夠從一個(gè)DNA隨機(jī)序列庫中篩選得到,目前已經(jīng)在很多領(lǐng)域有所應(yīng)用。所以,在實(shí)驗(yàn)室,我們假定具有熒光催化能力的DNA分子能夠檢測由特殊癌癥細(xì)胞所產(chǎn)生的胞外分泌混合物,進(jìn)而其能夠被開發(fā)為癌癥早期檢測的探針。我們決定選用的具有熒光催化能力的探針是基于能對RNA切割并產(chǎn)生熒光信號的催化DNA。該種DNA分子在其嵌入了一個(gè)單獨(dú)的RNA殘基,并且在該殘基的兩端分別修飾了一個(gè)熒光分子集團(tuán)和一個(gè)淬滅分子集團(tuán)。這些巧妙的結(jié)構(gòu)特征的設(shè)計(jì)目的是:在同一條鏈上的DNAzyme催化切割斷自身的RNA殘基后,能夠釋放出強(qiáng)烈的熒光信號。最終,我們開發(fā)出了具有RNA剪切功能的催化DNA分子——LYF5,該催化DNA分子能夠特異地識別人類乳腺癌細(xì)胞T47D的胞外培養(yǎng)液,在體外,其熒光檢測信號最低能檢測500個(gè)細(xì)胞每毫升T47D培養(yǎng)濃度。經(jīng)過DNA一級序列和二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化后,第二代的熒光探針分子(2G-LYF5)是第一代探針LYF5的催化活性的約兩倍。此外,我們還發(fā)現(xiàn)第二代熒光分子的二級發(fā)卡結(jié)構(gòu)在其催化切割功能中發(fā)揮了決定性的作用。因此,該分子將有希望開發(fā)為臨床上作為乳腺癌早期診斷的探針。
[Abstract]:Cancer is one of the world's most deadly human diseases. Currently, among all the cancers worldwide, breast cancer is the most diagnosed among women, accounting for about a quarter of all cancers. The incidence of breast cancer in developing countries has continued to rise with the continued development of the global economy and the prevalence of the way of life in the West. In the medical clinical study, different stages of breast cancer have different clinical manifestations and treatment options. Although there have been some early diagnostic methods, such as mammography, nuclear magnetic resonance imaging, and the like, most of the breast cancer in developing countries has been in the late stage of breast cancer development at the time of discovery. This is because these traditional methods have the disadvantages of high price, high dependence of the detection equipment, and the complicated checking process. Therefore, it is of great significance to develop a simple and rapid method of breast cancer detection to improve the survival rate of breast cancer patients. The in vitro serum detection established using the extracellular secretion mixture of breast cancer is no doubt the best method. Based on this need, we try to develop a new method of detecting breast cancer, which relies primarily on a single-stranded deoxyribose nucleic acid molecule (DNAzyme) with a catalytic activity or called an aptamer. This catalytic DNA molecule can be screened from a DNA random sequence library using an exponential-enriched ligand system evolution technique (SELEX), which has been applied in many fields. Therefore, in the laboratory, we assume that a DNA molecule with a fluorescence catalytic capability can detect an extracellular secretion mixture produced by a particular cancer cell, and further it can be developed as a probe for early detection of cancer. Our decision to select a probe with a fluorescence catalytic capability is based on the catalytic DNA that can cut the RNA and produce a fluorescence signal. The DNA molecule has a single RNA residue embedded therein, and a fluorescent molecule group and a quencher molecule group are modified at both ends of the residue, respectively. These ingenious structural features are designed to release a strong fluorescence signal after cleavage of its own RNA residue with the DNAzyme on the same strand. Finally, we developed a catalytic DNA molecule _ LYF5 with an RNA shearing function, which can specifically identify the extracellular medium of human breast cancer cell T47D. In vitro, its fluorescence detection signal can detect the minimum of 500 cells per milliliter of T47D culture concentration. The second generation of the fluorescence probe molecules (2G-LYF5) is about twice the catalytic activity of the first-generation probe LYF5 after the DNA-level sequence and the secondary-structure optimization. In addition, we have also found that the secondary hairpin structure of the second generation of fluorescent molecules plays a decisive role in its catalytic cutting function. Thus, the molecule will have the desire to develop a probe that is clinically useful as an early diagnosis of breast cancer.
【學(xué)位授予單位】:清華大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號】:R737.9

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本文編號:2436079

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