發(fā)布時間：2019-03-04 08:22

【摘要】：研究背景卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,臨床上缺乏實用的早期預防和治療手段,約70%的患者在就診時已為晚期,而且預后較差,2016年統(tǒng)計的5年生存率不到27%;因此美國政府發(fā)起的癌癥基因組圖譜(TCGA)計劃將其列為首批研究的三大腫瘤之一。闡明卵巢癌轉(zhuǎn)移、復發(fā)和耐藥的分子機制,尋找有效的治療靶點成為提高卵巢癌患者生存率的關鍵,也是卵巢癌研究面臨的重要課題。選擇性剪接(Alternative splicing,AS)是指將同一種前體mRNA剪接成多種不同的成熟mRNA剪接變異體,進而產(chǎn)生具有不同結(jié)構和功能蛋白質(zhì)的過程。選擇性剪接參與細胞的生長、分化、凋亡等重要生物學過程,與人類遺傳病、腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關。我們利用表達譜結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中表達上調(diào)的10個通路中剪接體通路排名第一位,進一步利用表達譜分析了 134個主控剪接因子,發(fā)現(xiàn)有33個在卵巢癌中表達顯著升高。USP39是我們發(fā)現(xiàn)的在高級別漿液性癌中顯著高表達的剪接因子,查閱文獻發(fā)現(xiàn)USP39在乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等多種癌組織中高表達并顯著促進腫瘤細胞的生長。USP39作為剪接體復合物的分子之一,參與招募tri-snRNP到剪接體復合物中發(fā)揮作用,參與mRNA剪接的調(diào)控。USP39在斑馬魚中參與到RB1(Retinoblastoma 1)剪切的調(diào)控;USP39通過選擇性剪接調(diào)控AuroraB的表達而影響U20S細胞的分裂過程。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)USP39在高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)組織中高表達,然而USP39在卵巢癌中的生物學功能及作用機制未見報道,USP39通過AS調(diào)控的選擇性剪接事件及關鍵下游分子網(wǎng)絡需要進一步研究明確。研究目的:本研究擬明確USP39在高級別漿液性癌中的表達及臨床意義;研究USP39對卵巢癌細胞的增殖、侵襲等惡性生物學特征的影響;篩選和鑒定USP39調(diào)控的選擇性剪接事件及下游關鍵分子。研究方法:利用表達譜芯片分析高級別漿液性癌組織(n=6)、正常輸卵管傘組織(n=6)中的差異基因表達;進一步利用生物信息學分析表達譜數(shù)據(jù)及TCGA數(shù)據(jù);Real-time PCR、免疫組化檢測正常及漿液性癌組織中USP39的表達。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體構建過表達和敲低USP39的卵巢癌細胞系,利用平板克隆、Transwell、流式細胞術檢測細胞周期驗證USP39的功能。分析USP39敲低細胞及對照細胞選擇性剪接表達譜篩選USP39下游調(diào)控的靶基因,并用qPCR進行驗證。在過表達和敲低USP39的細胞中檢測HMGA2的表達情況,用Northern blot、小基因模型(minigene)等方法研究USP39對HMGA2的調(diào)控。研究結(jié)果:1、USP39在高級別漿液性癌組織中顯著高表達并與患者預后相關我們利用表達譜結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中表達上調(diào)的10個通路中剪接體通路排名第一位,進一步利用表達譜分析了 134個主控剪接因子,發(fā)現(xiàn)有33個在卵巢癌中表達顯著升高。USP39是我們發(fā)現(xiàn)的在高級別漿液性癌中顯著高表達的剪接因子(表達譜中上調(diào)7.3倍,蛋白質(zhì)組上調(diào)3.4倍);TCGA數(shù)據(jù)分析表明,USP39在高級別漿液性癌(n=585)中明顯高于正常組織(n=8)(P0.0001);qPCR及免疫組化驗證也發(fā)現(xiàn)USP39在卵巢癌中的表達水平明顯高于正常輸卵管傘。利用TCGA數(shù)據(jù)進行預后分析發(fā)現(xiàn),USP39高表達的患者預后較差(P0.05)。2、USP39促進卵巢癌細胞增殖、侵襲等惡性生物學行為為闡明USP39在高級別漿液性癌中高表達的生物學意義,我們建立了USP39過表達和低表達細胞系,并進行了系列體外實驗。平板克隆形成實驗結(jié)果,過表達USP39的A2780、HO8910細胞的克隆形成數(shù)目和大小明顯高于對照組,敲低USP39的A2780、SKOV3細胞的克隆形成數(shù)目和大小低于對照組;細胞周期分析顯示敲低USP39使細胞停留在在Go/G1期,Western blot檢測細胞周期相關蛋白發(fā)現(xiàn)敲低USP39的細胞p53、p27表達上調(diào),CyclinDl表達下調(diào)。以上實驗表明USP39能夠顯著促進卵巢癌細胞的增殖能力。為進一步研究USP39影響卵巢癌細胞的惡性行為,我們進行了Transwell侵襲實驗,結(jié)果顯示過表達USP39的A2780、HO8910細胞的穿壁細胞數(shù)目高于對照組,敲低USP39的A2780、SKOV3細胞的穿壁細胞數(shù)目低于對照組。隨后我們利用Western blot檢測了上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關標記物,結(jié)果顯示過表達USP39的細胞β-catenin、Vimentin、Snail、Slug上調(diào);敲低者結(jié)果相反。說明USP39促進卵巢癌細胞的侵襲力和EMT進程。3、USP39調(diào)控的選擇性剪接事件及關鍵靶基因利用建立的USP39低表達及對照細胞系進行選擇性剪接表達譜芯片分析,發(fā)現(xiàn)敲低USP39引起了 2500多個選擇性剪接事件的變化,影響最多的選擇性剪接方式是盒式外顯子,另外還影響到可變的5'端或3'端及內(nèi)含子保留,而對不相容性剪接幾乎沒有影響。課題組進一步篩選出剪接指數(shù)較高(絕對值大于3),而且在USP39敲低的細胞中表達下調(diào)的的腫瘤相關基因進行驗證。發(fā)現(xiàn)PARP1、ZEB1、HMGA2、RAD51、MDC1基因的表達在USP39敲低細胞中mRNA的表達水平顯著降低。4、USP39通過選擇性剪接調(diào)控HMGA2基因的表達我們以前的研究結(jié)果顯示HMGA2在卵巢癌中高表達并于患者預后相關,HMGA2顯著促進卵巢細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此,我們選擇HMGA2做進一步的研究。qPCR及Western-blot結(jié)果表明,HMGA2在USP39過表達的細胞中表達升高,在敲低USP39的細胞中表達下降。利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)USP39和HMGA2相關系數(shù)為0.3167,為中度相關(P0.001)。通過構建Mingene(野生型和突變型載體),共轉(zhuǎn)染Minigene及發(fā)現(xiàn)在過表達USP39的293T細胞中HMGA2 minigene M0的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了改變,USP39過表達會促進短的轉(zhuǎn)錄本增多,USP39對HMGA2轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控屬于3'剪接位點選擇方式,USP39調(diào)控HMGA2minigene依賴內(nèi)含子3的3'剪接位點的強弱。結(jié)論1.USP39在高級別漿液性癌組織中顯著高表達并與患者預后相關。2.USP39促進卵巢癌細胞增殖、侵襲等惡性生物學行為。3.USP39調(diào)控多個選擇性剪接事件的變化及關鍵腫瘤相關基因的表達。4.USP39對HMGA2轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控屬于3'剪接位點選擇方式,USP39過表達會促進短的轉(zhuǎn)錄本增多,并上調(diào)HMGA2蛋白的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

【相似文獻】

相關期刊論文 前4條

1 張寒;鄭胡鏞;;絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用[J];中國腫瘤生物治療雜志;2013年06期

2 韓冷;李稚鋒;任長虹;孟祥勛;張成崗;;神經(jīng)系統(tǒng)特異性剪接因子NOVA研究進展[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2008年06期

3 金玉祥,姚敏,邢苗;剪接因子SC35在大鼠胸腺細胞內(nèi)的定位[J];解剖學通報;2003年03期

4 李力,張令強,賀福初;SR蛋白在幾種生物中的缺陷型研究進展[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2004年06期

相關會議論文 前1條

1 程虹;劉柏麟;沈萬安;張菊;;雌激素對大鼠肝臟B族清道夫受體異構體表達的調(diào)節(jié)作用[A];中華醫(yī)學會病理學分會2007年學術年會暨第九屆全國病理大會論文匯編[C];2007年

相關碩士學位論文 前4條

1 李杰銀;剪接因子USP39促進卵巢癌惡性行為的作用及機制[D];山東大學;2017年

2 劉靜;新診斷急性粒細胞白血病剪接因子異常表達研究[D];南昌大學;2012年

3 魏官云;人類啟動子系統(tǒng)分析及轉(zhuǎn)錄因子與剪接因子互作網(wǎng)絡分析[D];內(nèi)蒙古科技大學;2014年

4 尹曉敏;Dyrk1A對剪接因子SRp55磷酸化作用的研究[D];南通大學;2008年

，

本文編號：2434102