【摘要】：研究背景卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,臨床上缺乏實用的早期預(yù)防和治療手段,約70%的患者在就診時已為晚期,而且預(yù)后較差,2016年統(tǒng)計的5年生存率不到27%;因此美國政府發(fā)起的癌癥基因組圖譜(TCGA)計劃將其列為首批研究的三大腫瘤之一。闡明卵巢癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥的分子機(jī)制,尋找有效的治療靶點成為提高卵巢癌患者生存率的關(guān)鍵,也是卵巢癌研究面臨的重要課題。選擇性剪接(Alternative splicing,AS)是指將同一種前體mRNA剪接成多種不同的成熟mRNA剪接變異體,進(jìn)而產(chǎn)生具有不同結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)的過程。選擇性剪接參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡等重要生物學(xué)過程,與人類遺傳病、腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。我們利用表達(dá)譜結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)的10個通路中剪接體通路排名第一位,進(jìn)一步利用表達(dá)譜分析了 134個主控剪接因子,發(fā)現(xiàn)有33個在卵巢癌中表達(dá)顯著升高。USP39是我們發(fā)現(xiàn)的在高級別漿液性癌中顯著高表達(dá)的剪接因子,查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)USP39在乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等多種癌組織中高表達(dá)并顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。USP39作為剪接體復(fù)合物的分子之一,參與招募tri-snRNP到剪接體復(fù)合物中發(fā)揮作用,參與mRNA剪接的調(diào)控。USP39在斑馬魚中參與到RB1(Retinoblastoma 1)剪切的調(diào)控;USP39通過選擇性剪接調(diào)控AuroraB的表達(dá)而影響U20S細(xì)胞的分裂過程。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)USP39在高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)組織中高表達(dá),然而USP39在卵巢癌中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制未見報道,USP39通過AS調(diào)控的選擇性剪接事件及關(guān)鍵下游分子網(wǎng)絡(luò)需要進(jìn)一步研究明確。研究目的:本研究擬明確USP39在高級別漿液性癌中的表達(dá)及臨床意義;研究USP39對卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)特征的影響;篩選和鑒定USP39調(diào)控的選擇性剪接事件及下游關(guān)鍵分子。研究方法:利用表達(dá)譜芯片分析高級別漿液性癌組織(n=6)、正常輸卵管傘組織(n=6)中的差異基因表達(dá);進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析表達(dá)譜數(shù)據(jù)及TCGA數(shù)據(jù);Real-time PCR、免疫組化檢測正常及漿液性癌組織中USP39的表達(dá)。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)和敲低USP39的卵巢癌細(xì)胞系,利用平板克隆、Transwell、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期驗證USP39的功能。分析USP39敲低細(xì)胞及對照細(xì)胞選擇性剪接表達(dá)譜篩選USP39下游調(diào)控的靶基因,并用qPCR進(jìn)行驗證。在過表達(dá)和敲低USP39的細(xì)胞中檢測HMGA2的表達(dá)情況,用Northern blot、小基因模型(minigene)等方法研究USP39對HMGA2的調(diào)控。研究結(jié)果:1、USP39在高級別漿液性癌組織中顯著高表達(dá)并與患者預(yù)后相關(guān)我們利用表達(dá)譜結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)的10個通路中剪接體通路排名第一位,進(jìn)一步利用表達(dá)譜分析了 134個主控剪接因子,發(fā)現(xiàn)有33個在卵巢癌中表達(dá)顯著升高。USP39是我們發(fā)現(xiàn)的在高級別漿液性癌中顯著高表達(dá)的剪接因子(表達(dá)譜中上調(diào)7.3倍,蛋白質(zhì)組上調(diào)3.4倍);TCGA數(shù)據(jù)分析表明,USP39在高級別漿液性癌(n=585)中明顯高于正常組織(n=8)(P0.0001);qPCR及免疫組化驗證也發(fā)現(xiàn)USP39在卵巢癌中的表達(dá)水平明顯高于正常輸卵管傘。利用TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn),USP39高表達(dá)的患者預(yù)后較差(P0.05)。2、USP39促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為為闡明USP39在高級別漿液性癌中高表達(dá)的生物學(xué)意義,我們建立了USP39過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞系,并進(jìn)行了系列體外實驗。平板克隆形成實驗結(jié)果,過表達(dá)USP39的A2780、HO8910細(xì)胞的克隆形成數(shù)目和大小明顯高于對照組,敲低USP39的A2780、SKOV3細(xì)胞的克隆形成數(shù)目和大小低于對照組;細(xì)胞周期分析顯示敲低USP39使細(xì)胞停留在在Go/G1期,Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)敲低USP39的細(xì)胞p53、p27表達(dá)上調(diào),CyclinDl表達(dá)下調(diào)。以上實驗表明USP39能夠顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。為進(jìn)一步研究USP39影響卵巢癌細(xì)胞的惡性行為,我們進(jìn)行了Transwell侵襲實驗,結(jié)果顯示過表達(dá)USP39的A2780、HO8910細(xì)胞的穿壁細(xì)胞數(shù)目高于對照組,敲低USP39的A2780、SKOV3細(xì)胞的穿壁細(xì)胞數(shù)目低于對照組。隨后我們利用Western blot檢測了上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)記物,結(jié)果顯示過表達(dá)USP39的細(xì)胞β-catenin、Vimentin、Snail、Slug上調(diào);敲低者結(jié)果相反。說明USP39促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲力和EMT進(jìn)程。3、USP39調(diào)控的選擇性剪接事件及關(guān)鍵靶基因利用建立的USP39低表達(dá)及對照細(xì)胞系進(jìn)行選擇性剪接表達(dá)譜芯片分析,發(fā)現(xiàn)敲低USP39引起了 2500多個選擇性剪接事件的變化,影響最多的選擇性剪接方式是盒式外顯子,另外還影響到可變的5'端或3'端及內(nèi)含子保留,而對不相容性剪接幾乎沒有影響。課題組進(jìn)一步篩選出剪接指數(shù)較高(絕對值大于3),而且在USP39敲低的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的的腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行驗證。發(fā)現(xiàn)PARP1、ZEB1、HMGA2、RAD51、MDC1基因的表達(dá)在USP39敲低細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平顯著降低。4、USP39通過選擇性剪接調(diào)控HMGA2基因的表達(dá)我們以前的研究結(jié)果顯示HMGA2在卵巢癌中高表達(dá)并于患者預(yù)后相關(guān),HMGA2顯著促進(jìn)卵巢細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此,我們選擇HMGA2做進(jìn)一步的研究。qPCR及Western-blot結(jié)果表明,HMGA2在USP39過表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)升高,在敲低USP39的細(xì)胞中表達(dá)下降。利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)USP39和HMGA2相關(guān)系數(shù)為0.3167,為中度相關(guān)(P0.001)。通過構(gòu)建Mingene(野生型和突變型載體),共轉(zhuǎn)染Minigene及發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)USP39的293T細(xì)胞中HMGA2 minigene M0的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了改變,USP39過表達(dá)會促進(jìn)短的轉(zhuǎn)錄本增多,USP39對HMGA2轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控屬于3'剪接位點選擇方式,USP39調(diào)控HMGA2minigene依賴內(nèi)含子3的3'剪接位點的強(qiáng)弱。結(jié)論1.USP39在高級別漿液性癌組織中顯著高表達(dá)并與患者預(yù)后相關(guān)。2.USP39促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為。3.USP39調(diào)控多個選擇性剪接事件的變化及關(guān)鍵腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。4.USP39對HMGA2轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控屬于3'剪接位點選擇方式,USP39過表達(dá)會促進(jìn)短的轉(zhuǎn)錄本增多,并上調(diào)HMGA2蛋白的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31

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本文編號：2434102