【摘要】：背景腫瘤已成為人類健康的主要威脅,腫瘤的危害主要來自腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞(CSC)是腫瘤轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞,能夠在全新組織環(huán)境定植、生存、繁殖。間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤細(xì)胞侵潤、轉(zhuǎn)移的啟始步驟,也是已分化腫瘤細(xì)胞重獲自我更新、繁殖分化潛能等干細(xì)胞特性的途徑。因此,EMT/CSC被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根源。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)作為EMT的重要誘導(dǎo)因子,與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管新生、病理分期、病人預(yù)后密切相關(guān)。多種固體腫瘤中,TGF-β過量表達(dá),并伴有下游分子表達(dá)或活性升高,活躍的TGF-β信號促進(jìn)了中晚期腫瘤的發(fā)展。Bmi-1是TGF-β信號的下游靶分子之一,參與EMT和CSC自我更新的主要癌基因,與腫瘤的惡性程度、浸潤轉(zhuǎn)移及療效預(yù)后都有密切關(guān)系。眾多科學(xué)家相信通過調(diào)控TGF-β/Smad信號通路的活性和抑制Bmi-1蛋白表達(dá)有助于抑制EMT/CSC,發(fā)揮抑癌功能。代謝重組是決定腫瘤細(xì)胞存活的重要因素。流行病學(xué)資料表明,肥胖、糖尿病等代謝性疾病患者發(fā)生腫瘤的風(fēng)險明顯高于其它人群,而二甲雙胍等降糖藥物的應(yīng)用有助降低腫瘤發(fā)生風(fēng)險。多項研究表明,以二甲雙胍為代表的AMPK激活劑(AICAR、苯乙雙胍、A769962)具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力;并且AMPK主要上游激酶LKB1對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移也有明顯的抑制作用,而且多種腫瘤組織的AMPK-Thr172磷酸化明顯低于癌旁或正常組織。AMPK的抑癌功能是公認(rèn)的,激活A(yù)MPK能夠增強(qiáng)能量瓶頸和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)對腫瘤過度增殖的限制功能,抑制增殖,促進(jìn)凋亡。因此,基因突變(如LKB1的突變)和腫瘤組織微環(huán)境改變所導(dǎo)致的AMPK活性下降成為腫瘤發(fā)展的重要原因。但目前關(guān)于AMPK對腫瘤轉(zhuǎn)移、EMT的抑制機(jī)制尚未能深入研究,本研究探討了TGF-β信號的過度活躍是否與AMPK活性下降有關(guān),以及激活A(yù)MPK能否抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、EMT、Bmi-1表達(dá)等熱點(diǎn)問題,對于腫瘤治療有重要意義。目的探討LKB1/AMPK對TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、EMT、Bmi-1表達(dá)及細(xì)胞遷移等生物行為的抑制作用。材料與方法1、細(xì)胞株包括:胃癌細(xì)胞AGS,SGC-7901,肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞,肺上皮細(xì)胞BEAS-2B,MEF,MDA-MB-231,NMu MG,MCF10A。2、以sh RNA敲除LKB1,或以慢病毒導(dǎo)入LKB1基因,構(gòu)建LKB1表達(dá)不同的細(xì)胞株,給予二甲雙胍等AMPK激活劑預(yù)處理,再用TGF-β1刺激,然后以免疫印跡技術(shù)檢測AMPK磷酸化、Smad磷酸化以及EMT標(biāo)志物的變化。3、將AMPK顯性失活的突變體和顯性活化的突變體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后,檢測AMPK磷酸化、Smad磷酸化以及EMT標(biāo)志物的變化。4、以Q-PCR檢測LKB1、AMPK化學(xué)激活劑對TGF-β下游靶基因m RNA表達(dá)的影響。5、以細(xì)胞劃痕或Transwell技術(shù)檢測細(xì)胞遷移速率,分析激活A(yù)MPK對細(xì)胞遷移的影響。6、收集糖尿病人血清,分為服用二甲雙胍和未服用患者;收集小鼠服用二甲雙胍前后的血清。以ELISA技術(shù)檢測人和小鼠血清TGF-β水平。7、以熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測激活A(yù)MPK對TGF-β1轉(zhuǎn)錄水平,Smad轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的影響。結(jié)果一、AMPK對TGF-β表達(dá)的抑制作用通過螢光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)二甲雙胍、苯乙雙胍處理后,TGF-β轉(zhuǎn)錄活性下降了50%;以ELISA分析人血清TGF-β1水平,結(jié)果表明服用二甲雙胍患者的TGF-β1水平低于未服用者,但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異,可能受病例不足影響;進(jìn)一步動物實驗,發(fā)現(xiàn)小鼠服用二甲雙胍后血中TGF-β1水平明顯低于服用前;以上結(jié)果提示,激活A(yù)MPK對TGF-β生成有抑制作用。激活A(yù)MPK導(dǎo)致TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制。乳腺癌細(xì)胞MCF10A和肺腺癌細(xì)胞A549LKB1中,給予二甲雙胍激活A(yù)MPK可以減弱Smad2/3磷酸化水平;另外,將AMPK持續(xù)激活突變體轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞,AMPK磷酸化增強(qiáng),Smad2/3磷酸化減弱。在LKB1表達(dá)缺乏細(xì)胞(如A549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞)中轉(zhuǎn)入LKB1基因,提高LKB1表達(dá)可以減弱TGF-β誘導(dǎo)Smad磷酸化,結(jié)果提示LKB1參與了AMPK對TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用。AMPK失活致使TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)。以顯性失活A(yù)MPKa1突變體抑制C4-2細(xì)胞內(nèi)源性AMPK、敲除MEF細(xì)胞中的AMPKα1和α2基因,或以sh RNA敲除乳腺癌細(xì)胞MCF10A中LKB1和AMPKα1等途徑阻止AMPK活化后,TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/3磷酸化均明顯增強(qiáng)。三、LKB1/AMPK對TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的抑制作用LKB1/AMPK對細(xì)胞遷移的抑制作用,在細(xì)胞劃痕和Transwell實驗中,TGF-β刺激能促進(jìn)A549細(xì)胞、Nu MG細(xì)胞、AGS細(xì)胞的遷移速率,而AMPK激活劑二甲雙胍和A769962對此有明顯抑制作用,而且LKB1的表達(dá)可以增強(qiáng)這種抑制作用。抑制AMPK活性致使細(xì)胞遷移速率明顯加快,通過顯性失活A(yù)MPKa1突變體抑制C4-2細(xì)胞內(nèi)源性AMPK活性后,細(xì)胞遷移明顯加快,而以多西環(huán)素恢復(fù)AMPK功能又可以抑制細(xì)胞遷移。另外,以sh RNA敲除BEAS-2B細(xì)胞的LKB1后,細(xì)胞遷移速率明顯增加。四、LKB1/AMPK對TGF-β誘導(dǎo)EMT的抑制作用A549細(xì)胞中,經(jīng)TGF-β1長時間刺激后,上皮細(xì)胞特征的標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下降,間質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物N-cadherin和Slug表達(dá)上升;同時給予苯乙雙胍和TGF-β1能抑制TGF-β1誘導(dǎo)EMT變化,引起E-cadherin表達(dá)水平增加,N-cadherin和Slug水平下降。乳腺上皮細(xì)胞NMu MG細(xì)胞,受TGF-β1因子刺激后,細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變,伴有E-cadherin表達(dá)下降,而N-cadherin,β-catenin,vimentin和Slug表達(dá)增加;二甲雙胍或AICAR能減弱TGF-β所誘導(dǎo)NMu MG細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞特征,逆轉(zhuǎn)以上反應(yīng)。在胃癌細(xì)胞AGS中,TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受二甲雙胍激活A(yù)MPK的抑制后,E-cadherin逐漸增強(qiáng),而N-cadherin、β-catenin、Vimentin等標(biāo)志物逐漸減弱,呈時間依賴性。二、LKB1/AMPK對TGF-β誘導(dǎo)Smad磷酸化的抑制作用五、LKB1/AMPK對TGF-β靶基因表達(dá)的調(diào)控作用Q-PCR檢測表明:二甲雙胍對PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4種TGF-β靶基因的表達(dá)水平無明顯影響,而TGF-β能誘導(dǎo)PAI-1、FN、CTGF、IL-6等4基因的表達(dá)。但是,二甲雙胍對TGF-β誘導(dǎo)基因表達(dá)有抑制作用,而且該抑制作用在LKB1高表達(dá)的細(xì)胞中更加明顯。六、LKB1/AMPK對Bmi-1基因表達(dá)的抑制作用二甲雙胍刺激A549細(xì)胞引起p-AMPK-Thr172表達(dá)升高,同時使Bmi-1的表達(dá)下降。LKB1高表達(dá)的細(xì)胞中,Bmi-1表達(dá)減弱,而LKB1低表達(dá)的細(xì)胞則Bmi-1表達(dá)更高。胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS受二甲雙胍刺激后,p AMPK和LITAF表達(dá)上調(diào),而Bmi-1表達(dá)下調(diào)。二甲雙胍刺激能夠通過LITAF使四種具有抑制Bmi-1表達(dá)的micro RNA明顯升高。結(jié)論:TGF-β是誘導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因子,LKB1/AMPK具有抑制TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其功能。激活A(yù)MPK可以抑制TGF-β信號對眾多靶基因調(diào)控,阻止EMT進(jìn)程,抑制β-catenin、Bmi-1等與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)基因的表達(dá),阻止腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
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【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
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本文編號：2429852