【摘要】：目的:大腸癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,在人群中有較高的發(fā)病率,隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,其發(fā)病率呈逐年上升之勢。世界范圍內(nèi)每年新增病例呈逐年上升,流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),各個國家地區(qū)之間的大腸癌發(fā)病率存在著顯著差異,在一些發(fā)達國家諸如澳洲、西歐、北美等發(fā)病以50-60/10萬居于最高,亞洲較低,全球范圍內(nèi)每年約有40萬人死于大腸癌。我國大腸癌的發(fā)病率與死亡率僅次于胃癌、肺癌、食管癌等常見的惡性腫瘤,是威脅人類健康的一大問題。其起病隱襲,發(fā)展緩慢,早期癥狀不明顯,晚期出現(xiàn)便血、梗阻、腹部腫塊等癥狀,嚴重危害人類生命健康。大腸癌發(fā)病機制復雜,侵襲和轉(zhuǎn)移是其預后差的主要原因,也是目前大腸癌研究的重點和難點。大腸癌惡性程度高,只有約75%的患者適宜于根治手術(shù),約20%左右的患者就診時已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。大腸癌術(shù)后復發(fā)率高,死于復發(fā)或者轉(zhuǎn)移的患者約占約40%~70%。與其發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子機制一直是人們關(guān)注的熱點,大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個由多因素參與、多步驟、多基因突變、多階段進展的過程,有多條信號轉(zhuǎn)導通路互相作用并互相調(diào)節(jié)。信號轉(zhuǎn)導通路的異常是大腸癌發(fā)生發(fā)展的主要因素。信號轉(zhuǎn)導通路與細胞生長增殖、分化、凋亡和代謝等一系列生理活動密切相關(guān)。并參與腫瘤細胞的分化、增殖以及調(diào)亡。細絲蛋白A(Filamin A,FLNa)又稱ABP-280。FLNa與Filamin B,Filamin C共同組成Filamin家族,其分子量280k Da,是一種非肌性肌動蛋白結(jié)合蛋白,其基因結(jié)構(gòu)高度保守,對哺乳動物的生長發(fā)育具有重要的作用。FLNa廣泛存在于細胞漿,少數(shù)跨膜或存在于細胞核內(nèi)。FLNa是“V”形的同型二聚體,由肌動蛋白結(jié)合區(qū)、24個重復β-折疊片層結(jié)構(gòu)以及兩個絞鏈區(qū)組成,一方面,其氨基末端可與肌動蛋白絲交聯(lián)而形成穩(wěn)定的細胞骨架,另一方面,其羧基末端可與細胞膜上的多種蛋白(如表皮生長因子受體)結(jié)合,進一步激活其下游如MAPK/ERK、PI3K/Akt等多條信號轉(zhuǎn)導通路,進而影響腫瘤的增殖、粘附、遷移和侵襲等行為。FLNa作為細胞內(nèi)絞手架蛋白,為細胞內(nèi)各種信號網(wǎng)絡(luò)中的蛋白分子提供絞手架。國外越來越多證據(jù)表明,FLNa與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),Zhu認為FLNa可調(diào)控人惡性黑色素瘤細胞表皮生長因子受體的活化,而FLNa是否對大腸癌SW480細胞表皮生長因子受體的活化及MAPK/ERK、PI3K/Akt轉(zhuǎn)導通路激活造成影響,目前尚無報道。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)又稱Erb B-1,是原癌基因c-erb B-1的表達產(chǎn)物,分子質(zhì)量為170KD。其與Erb B-2/HER-2、Erb B-3/HER-3和Erb B-4/HER-4共同組成受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族。這些受體酪氨酸激酶家族成員均具有三個結(jié)構(gòu)域,胞外區(qū)(配體結(jié)合區(qū))、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)(酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域)。其中酪氨酸激酶活性代表了它的有效結(jié)構(gòu),并且是信號傳導的基礎(chǔ),其特異性的配體,如表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)、雙向調(diào)節(jié)蛋白(AR)與其結(jié)合后,可導致胞內(nèi)酪氨酸激酶域活化,從而形成同源或異源二聚體,引起下游多條信號轉(zhuǎn)導通路如MAPK/ERK、PI3K-Akt等激活,進一步影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。EGFR信號轉(zhuǎn)導通路在大腸癌(colorectal cancer,CRC)形成中具有重要的作用,65%~70%的大腸腫瘤中EGFR為高表達,EGFR的表達與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)受累及范圍、血管浸潤轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。EGFR是酪氨酸激酶家族中最重要的成員,其過表達及活化與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。PI3K/Akt通路是目前研究腫瘤發(fā)生的熱點,絲蘇氨酸激酶(serine/threonine,Akt)是由480個氨基酸組成的蛋白激酶,由三部分構(gòu)成:氨基末端的PH結(jié)構(gòu)域,中部的催化活性區(qū)和羧基末端的調(diào)節(jié)活性區(qū)。Akt與許多腫瘤的生物學特性都有關(guān)系,包括抑制細胞凋亡,促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,引起細胞增殖,促進血管生成等。Akt為存在于多個信號轉(zhuǎn)導通路中的效應蛋白,起著關(guān)鍵的中樞作用,其對于維持細胞正常生理功能發(fā)揮重要作用�？蓪毎M行磷酸化修飾,磷酸化修飾作用失調(diào)導致細胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生。p-Akt是Akt的活化形式,只有在活化狀態(tài)下才具有生物學活性,在PI3K作用下充分激活,參與介導細胞生長、增殖。PI3K/Akt信號通路參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,定位于胞漿,激活后轉(zhuǎn)位至胞核。其主要受上游蛋白EGFR調(diào)控,Ras-Raf-1-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導通路激活后,可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性,導致細胞增殖、分化。Ras-Raf-1-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導通路是細胞外信號通路,在大多數(shù)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用。ERK家族包括ERK1-ERK5亞族,其中ERK1和ERK2表達廣泛,功能涉及有絲分裂及分裂后期等一系列的細胞生理活動的調(diào)節(jié)。本研究首先對大腸癌細胞HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480進行篩選,通過蛋白印跡(Western blot)方法選取高表達FLNa的SW480細胞作為本研究所用。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)FLNa的表達,通過蛋白印跡(Western blot)驗證沉默效果。利用MTS(增殖實驗)、Wound healing(劃痕修復實驗)和Transwell(侵襲實驗)觀察FLNa對大腸癌SW480細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為的影響。經(jīng)Western blot實驗方法進一步從EGFR及其下游信號轉(zhuǎn)導通路中各分子的活化水平進行探討FLNa對大腸癌SW480細胞的調(diào)控機制。收集臨床標本,通過免疫組織化學法探討人大腸癌組織中FLNa的表達與臨床病理的關(guān)系。本研究分以下三個部分:第一部分細絲蛋白A對體外培養(yǎng)大腸癌細胞生物學行為的影響方法:1細胞復蘇和培養(yǎng)將大腸癌細胞HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480凍存管從液氮中取出,融化后用含10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100IU/ml的1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 Western blot法檢測不同大腸癌細胞中FLNa的表達情況培養(yǎng)不同大腸癌細胞株HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480,Western blot法檢測各細胞株FLNa的表達水平。3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立沉默F(xiàn)LNa的大腸癌SW480細胞株將細胞分為三組:空白組,對照組及實驗組,其中空白組不進行處理,將FLNash RNA質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人大腸癌細胞SW480,經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的沉默F(xiàn)LNa表達的SW480細胞株(SW480/KD)及對照組細胞株(SW480/Ctrl);利用Western blot檢測3組細胞中FLNa蛋白的表達水平。4 MTS比色分析法分別檢測2組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的增殖能力分別將SW480/KD細胞及SW480/Ctrl細胞消化后接種于96孔板,給予不同濃度(濃度依次為0n M、4n M、20n M、100n M)的EGF刺激,而后加入MTS,在酶標儀490納米波長處對96孔板進行吸光度值的測定,檢測2組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的增殖能力。5 Wound healing實驗對2組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株分別進行各個時間點的遷移能力的檢測SW480/KD及SW480/Ctrl細胞消化后分別接種于無菌的24孔板,用不含胎牛血清的不完全1640培基饑餓4小時后,用10μl的移液器吸頭垂直孔底進行劃痕,并將兩種細胞各自分別分為無EGF刺激組和20n M EGF刺激組,顯微鏡下觀察劃痕愈合情況,并計時拍照。6 Transwell法對2組細胞分別進行的侵襲能力的檢測將基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室,將SW480/KD及SW480/Ctrl兩組細胞接種于上室,上室培養(yǎng)液不含胎牛血清,下室培養(yǎng)液含10%胎牛血清,孵育24h后將小室取出,95%冰乙醇固定、HE染色,顯微鏡下統(tǒng)計穿過微孔膜細胞數(shù)目。結(jié)果:1不同大腸癌細胞株中FLNa的表達情況利用Western blot檢測大腸癌細胞HCT116、T84、HT29、SW837、SW620、SW480細胞中FLNa蛋白表達相對灰度值分別為(0.02±0.00),(0.02±0.00),(0.00±0.00),(0.05±0.00),(0.02±0.00),(0.09±0.00)。其中SW480細胞中FLNa的表達水平是最高的(P0.01)。2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中FLNa的蛋白水平檢測Western blot檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞FLNa蛋白的水平,結(jié)果顯示,SW480/KD細胞FLNa的相對表達量(0.48±0.00)明顯低于SW480/Ctrl細胞(1.13±0.03),有統(tǒng)計學意義(P0.01)。3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖情況MTS法檢測2組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大腸癌細胞的增殖能力,其結(jié)果分別為:SW480/KD組各濃度的OD值(0.99±0.03,1.23±0.04,1.52±0.01,1.90±0.01)明顯高于SW480/Ctrl組(0.49±0.00,0.70±0.00,0.98±0.01,1.31±0.04),均有統(tǒng)計學意義(P0.01)4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FLNa大腸癌細胞株的遷移情況利用劃痕修復實驗檢測2組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的大腸癌轉(zhuǎn)染細胞(每組分為EGF刺激及無EGF刺激)的遷移能力,其結(jié)果分別為:無EGF刺激時,SW480/KD組各時間點的遷移率(0h,8h、16h、24h)(0.00±0.00,5.67±1.03%,19.85±0.95%,32.42±1.71%)均明顯高于SW480/Ctrl組(0.00±0.00%,4.95±0.37%,9.94±0.44%,19.34±0.23%),均具有統(tǒng)計學意義(P0.01);給予20n M EGF刺激時,SW480/KD組各時間點的遷移率(0.00±0.00%,11.56±1.47%,21.57±0.47%,50.00±0.00%)均明顯高于SW480/Ctrl組(0.00±0.00%,6.19±0.51%,9.94±0.44%,22.27±0.26%),均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的侵襲情況Transwell法檢測穩(wěn)定2組轉(zhuǎn)染大腸癌細胞的侵襲能力,其結(jié)果分別為:SW480/KD組穿過微孔膜細胞數(shù)(62±3)明顯高于SW480/Ctrl組(18±1),有統(tǒng)計學意義(P0.01)。第二部分細絲蛋白A影響大腸癌細胞生物學行為的機制研究方法:Western blot檢測穩(wěn)定2組細胞FLNa、EGFR、p-EGFR、p-Akt、Akt、p-ERK、ERK蛋白表達情況。對兩組細胞分別在0min、5min、10min、30min給予20n M EGF刺激,收集細胞后,提取蛋白,進行蛋白定量,然后Western-blot檢測各時間點FLNa、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、p-ERK、ERK蛋白的表達情況,統(tǒng)計分析。結(jié)果:沉默F(xiàn)LNa的表達對大腸癌細胞SW480 EGFR活化的影響統(tǒng)計結(jié)果顯示,經(jīng)EGF刺激各時間點(0min、5min、10min、30min)FLNa的表達量:SW480/KD組(0.38±0.05,0.41±0.03,0.32±0.02,0.34±0.06)均明顯低于SW480/Ctrl組(0.92±0.08,0.89±0.07,0.88±0.06,0.90±0.05)的表達水平,均有統(tǒng)計學意義(P0.01);SW480/KD組p-EGFR水平于刺激后5min、10min、30min后的表達水平(0.40±0.09,0.33±0.06,0.25±0.04)均明顯高于SW480/Ctrl組(0.27±0.08,0.13±0.02,0.05±0.04),均有統(tǒng)計學意義(P0.01);SW480/KD組p-ERK的表達水平分別為(0.39±0.02,0.49±0.08,0.34±0.06)均明顯高于SW480/Ctrl組(0.30±0.01,0.16±0.01,0.11±0.01),均有統(tǒng)計學意義(P0.01);SW480/KD組p-Akt的表達水平(1.36±0.12,1.02±0.15,0.85±0.09)均明顯高于SW480/Ctrl組(0.60±0.034,0.21±0.02,0.05±0.01),均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。第三部分大腸癌組織中細絲蛋白A蛋白表達與臨床病理特征的相關(guān)性方法:隨機選取82例經(jīng)手術(shù)切除確診為大腸癌的石蠟標本,病例資料完整,采用免疫組織化學第二代聚合酶二步法(PV)檢測其FLNa、EGFR和Ki-67的在大腸癌組織中的表達情況。分析研究FLNa在大腸癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果:1 FLNa在大腸癌組織中主要為胞漿染色,EGFR在大腸癌組織中主要分布在細胞膜和細胞質(zhì),陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,胞核不著色。FLNa蛋白陽性表達率為51.2%(42/82),EGFR蛋白表達陽性率為52.4%(43/82)。Ki-67蛋白在細胞核表達,陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,陽性表達率為53.7%(44/82)。2 FLNa和Ki-67與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系在82例大腸癌組織中,FLNa蛋白的表達與年齡、性別和腫瘤大小、分化程度等無關(guān);與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān),其差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)3 FLNa與Ki-67在大腸癌組織中表達的相關(guān)性FLNa和Ki-67表達共陽性者16例,共陰性者12例,二者的表達呈負相關(guān)(r=-0.320,P0.01)。4 EGFR與Ki-67在大腸癌組織中的表達相關(guān)性EGFR和Ki-67表達共陽性者25例,共陰性者30例,二者的表達呈正相關(guān)(r=0.339,P0.01)。結(jié)論:1體外實驗表明下調(diào)FLNa表達可促進大腸癌細胞SW480的增殖、遷移和侵襲能力;2 FLNa通過調(diào)控大腸癌細胞EGFR的磷酸化,影響MAPK/ERK、PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路活化,進而影響其一系列生物學行為;3 FLNa表達程度與人大腸癌組織臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),FLNa在大腸癌組織表達與Ki-67呈負相關(guān),抑制腫瘤生長。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王麗鴻;;分子靶向抗癌藥物的研究進展[J];牡丹江醫(yī)學院學報;2013年02期

2 陳乃玲;;大腸癌EGFR拮抗劑靶向治療的進展與思考[J];胃腸病學和肝病學雜志;2009年12期

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本文編號：2429267