【摘要】：研究背景:肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一。目前肺癌的主要治療手段是手術(shù)、化療和放療等,但是治療效果極差,五年生存率低于百分之二十。肺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡率居高不下的主要原因。因此,我們以肺癌為研究對象,重點(diǎn)探索轉(zhuǎn)錄因子異常表達(dá)對腫瘤細(xì)胞侵潤轉(zhuǎn)移的作用。我們實(shí)驗(yàn)室主要研究肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Aiolos異位表達(dá)可以抵抗失巢凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。該部分研究結(jié)果已于2014年在Cancer Cell雜志上發(fā)表。并且在研究轉(zhuǎn)錄因子Aiolos促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)現(xiàn),Aiolos的異位表達(dá)可以顯著降低另一種轉(zhuǎn)錄因子PRDM1的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄抑制因子PRDM1也被稱為Blimp1,主要參與β-干擾素基因的表達(dá)沉默、B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、T淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)控制、原始生殖細(xì)胞的特化和遷移、表皮細(xì)胞終末分化和皮脂腺干細(xì)胞的維持等過程。PRDM1在腫瘤中作用的研究,主要集中在血液系統(tǒng),PRDM1的基因結(jié)構(gòu)改變、蛋白表達(dá)異常常與惡性淋巴瘤、白血病的發(fā)生相關(guān)。目前只有少量報(bào)道涉及PRDM1在實(shí)體腫瘤中的作用。PRDM1表達(dá)下降可提高膠質(zhì)瘤的惡性度;而下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中的PRDM1表達(dá)則抑制細(xì)胞遷移。因此,PRDM1基因在實(shí)體腫瘤中到底發(fā)揮是抑癌基因的作用,還是促癌基因作用,以及PRDM1在肺癌中的詳細(xì)具體的作用機(jī)制,都需要我們更加深入的研究。研究目的:通過觀測細(xì)胞行為變化,闡明肺癌細(xì)胞中PRDM1表達(dá)下調(diào)所產(chǎn)生的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng);通過檢測m RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,探討肺癌細(xì)胞中下調(diào)PRDM1表達(dá)所引起的細(xì)胞行為變化的具體分子機(jī)制;通過尾靜脈注射小鼠成瘤實(shí)驗(yàn),明確PRDM1與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)性;通過表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)、表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)和多種細(xì)胞系的PRDM1表達(dá)水平的RT-PCR檢測,確定PRDM1和Aiolos的負(fù)相關(guān)性;通過研究轉(zhuǎn)錄因子和DNA相互作用,探討肺癌細(xì)胞中PRDM1表達(dá)缺失的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。綜合以上研究,進(jìn)一步深化肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的的分子機(jī)制,為惡性肺癌的分子治療提供新的治療靶點(diǎn)。研究方法和研究結(jié)果:1.通過分析過表達(dá)Aiolos的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),確定研究目標(biāo)為PRDM1;2.分析206個(gè)肺表皮細(xì)胞系其中包括59個(gè)正常肺表皮細(xì)胞系和147個(gè)肺癌細(xì)胞系中的microarray結(jié)果,確定PRDM1異常表達(dá)與肺癌形成和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;3.以慢病毒為載體,下調(diào)A549細(xì)胞的PRDM1表達(dá),通過Transwell實(shí)驗(yàn)、Fibronectin實(shí)驗(yàn)、Cell Death實(shí)驗(yàn)和三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等,檢測細(xì)胞的行為變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)PRDM1后,細(xì)胞的侵襲能力、黏附能力和抗凋亡能力增高;4.以慢病毒為載體,下調(diào)A549細(xì)胞的PRDM1,并通過Real-time PCR和Western blot檢測m RNA和蛋白質(zhì)的變化,發(fā)現(xiàn)下調(diào)PRDM1后,Fibronectin蛋白表達(dá)增高;5.以慢病毒為載體,將下調(diào)PRDM1表達(dá)的A549細(xì)胞采用尾靜脈注射裸鼠,觀察小鼠的存活時(shí)間,并解剖取肺、心、肝、脾、腎,制成冰凍切片和石蠟切片,發(fā)現(xiàn)所有老鼠的肺部都檢測到有腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成,但是在其他組織中則沒有發(fā)現(xiàn)有腫瘤的形成。下調(diào)PRDM1組的小鼠的存活時(shí)間明顯比對照組短。尾靜脈注射小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管后形成腫瘤的情況。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,下調(diào)PRDM1后,細(xì)胞的失巢凋亡抵抗能力和黏附能力增強(qiáng),因此使下調(diào)PRDM1的細(xì)胞獲得更多的存活時(shí)間,并且更易于黏附在其它器官上形成腫瘤。6.通過轉(zhuǎn)錄組測序和多種細(xì)胞系RT-PCR檢測,確定PRDM1和Aiolos的負(fù)相關(guān)性;并通過對過表達(dá)Aiolos細(xì)胞的PRDM1的表達(dá)水平檢測,確定在轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,PRDM1位于Aiolos的下游,受Aiolos的調(diào)控;7.通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),確定Aiolos可以結(jié)合到PRDM1的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū),并抑制PRDM1的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:1.肺癌細(xì)胞通過下調(diào)PRDM1的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞的黏附能力、侵襲能力、抗失巢凋亡能力和從原位細(xì)胞團(tuán)上脫離的能力;2.與對照組相比,下調(diào)PRDM1的腫瘤細(xì)胞尾靜脈注射裸鼠,存活時(shí)間縮短;3.在肺癌中轉(zhuǎn)錄因子Aiolos可以結(jié)合到PRDM1基因的啟動(dòng)子區(qū),抑制PRDM1的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：2428155