【摘要】：胃癌是全球第四大最常見(jiàn)的惡性腫瘤,我國(guó)的發(fā)病率則明顯高于全球平均水平。由于胃癌患者無(wú)特異性的早期癥狀,近一半的胃癌患者在被診斷時(shí)已經(jīng)進(jìn)展到晚期,預(yù)后較差。胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及一系列癌基因的激活和抑癌基因的失活。篩查這些基因并研究其作用機(jī)制對(duì)于胃癌的早期診斷和治療具有重要的價(jià)值。 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(Insulin-like growth factor binding protein-3, IGFBP3)是IGFBP家族的主要組成成分,主要通過(guò)和循環(huán)中的I型胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)結(jié)合而發(fā)揮作用。既往研究表明,IGFBP3在多種腫瘤中表達(dá)異常,主要影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程,對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的報(bào)道則較少。同源盒基因D10(homeobox D10, HoxD10)可以編碼轉(zhuǎn)錄因子,我們的既往研究發(fā)現(xiàn)HoxD10可以影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移侵襲等行為。通過(guò)基因表達(dá)譜芯片篩選發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞中,包括IGFBP3在內(nèi)的多個(gè)基因可能受到HoxD10的調(diào)節(jié)。因此,我們推測(cè)IGFBP3可能作為轉(zhuǎn)錄因子HoxD10的下游靶點(diǎn),影響胃癌的生物學(xué)行為。 為證實(shí)此推測(cè),在本研究中,我們通過(guò)對(duì)胃癌組織芯片進(jìn)行免疫組化檢測(cè),分析胃癌與癌旁IGFBP3蛋白表達(dá)水平的差異及IGFBP3表達(dá)同患者TNM分期和生存期等的相關(guān)性。通過(guò)劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn),研究IGFBP3沉默表達(dá)后對(duì)胃癌細(xì)胞遷移侵襲的影響,并檢測(cè)遷移侵襲相關(guān)因子尋找可能的機(jī)制。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),明確了HoxD10蛋白對(duì)IGFBP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 研究方法 1.胃癌組織中IGFBP3表達(dá)水平和臨床資料的相關(guān)性分析 (1)IGFBP3抗體對(duì)含有胃癌和癌旁配對(duì)組織的組織芯片進(jìn)行免疫組化染色,分析癌與癌旁IGFBP3表達(dá)的差異。 (2)分析胃癌組織中IGFBP3的表達(dá)和患者TNM分期、病理分級(jí)及生存期等的相關(guān)性。 2. IGFBP3對(duì)胃癌細(xì)胞遷移侵襲的作用及可能的機(jī)制 (1)采用劃痕試驗(yàn)、Transwell遷移試驗(yàn)檢測(cè)siRNA靶向干擾IGFBP3表達(dá)后,胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901遷移能力的變化。 (2)鋪基質(zhì)膠的Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)siRNA靶向干擾IGFBP3表達(dá)后,胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901侵襲能力的變化。 (3) RT-PCR和Western blotting檢測(cè)siRNA靶向干擾IGFBP3表達(dá)后,遷移侵襲相關(guān)因子表達(dá)水平的變化。 3.胃癌細(xì)胞中HoxD10對(duì)IGFBP3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 (1)采用RT-PCR, Western blotting和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng),在胃癌細(xì)胞BGC823和SGC7901中,檢測(cè)HoxD10過(guò)表達(dá)后,IGFBP3的mRNA.蛋白質(zhì)及啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的變化。 (2)利用啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件PROMO預(yù)測(cè)IGFBP3啟動(dòng)子區(qū)域可能和轉(zhuǎn)錄因子HoxD10結(jié)合的位點(diǎn),以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物,采用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)能夠募集HoxD10的位點(diǎn)。 (3)采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)鑒定HoxD10的活性結(jié)合位點(diǎn),對(duì)核心結(jié)合序列進(jìn)行點(diǎn)突變后再次檢測(cè)熒光素酶活性的變化是否被沉默。 研究結(jié)果 1.胃癌組織中IGFBP3表達(dá)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān) (1)胃癌組織中IGFBP3的表達(dá)顯著低于配對(duì)的癌旁組織(p0.01)。 (2) IGFBP3高表達(dá)的患者處在高淋巴結(jié)分期N2+N3的比例顯著低于IGFBP3低表達(dá)的患者(p0.05),清掃出的總淋巴結(jié)中出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的比例亦顯著較低(p0.01)。 (3)IGFBP3高表達(dá)患者4.5年的生存率顯著高于IGFBP3低表達(dá)的患者(p0.01)。 2. IGFBP3抑制胃癌細(xì)胞的遷移侵襲 (1)在不同野生胃細(xì)胞株中,HGC27表達(dá)IGFBP3相對(duì)最高,BGC823、SGC7901和GES-1表達(dá)次之,AGS、MKN28、MKN45、NCI-N87和MGC803則低表達(dá)。 (2) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,BGC823和SGC7901劃痕的愈合顯著加快,12h和24h的遷移率明顯提高(p0.01)。 (3) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,遷移到Transwell小室下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加(p0.01)。 (4) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,穿過(guò)基質(zhì)膠侵襲到Transwell小室下層的細(xì)胞明顯增多,下層細(xì)胞洗脫后的OD值顯著增加(p0.01)。 (5) siRNA干擾IGFBP3的表達(dá)后,MMP14,uPA和uPAR的mRNA表達(dá)量顯著增加。 1.胃癌細(xì)胞中HoxD10在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控IGFBP3的表達(dá) (1) pcDNA3.1-HoxD10轉(zhuǎn)染的BGC823和SGC7901中HoxD10的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高,同時(shí)伴隨著IGFBP3的mRNA和蛋白表達(dá)水平的明顯增高。 (2)轉(zhuǎn)染HoxD10后IGFBP3啟動(dòng)子報(bào)告基因熒光素酶活性顯著增加(p0.01)。PROMO軟件預(yù)測(cè)顯示IGFBP3轉(zhuǎn)錄上游2.3kb有5個(gè)可能和HoxD10結(jié)合的位點(diǎn)HBS1-5。 (3)以HoxD10抗體沉淀的核酸為模板,HBS3、HBS4和HBS5引物可以擴(kuò)增出明顯條帶；HoxD10過(guò)表達(dá)后,HBS3、HBS4或HBS5的報(bào)告基因熒光素酶相對(duì)活性均顯著增加(p0.01),突變的HBS3、HBS4和HBS5報(bào)告基因熒光素酶相對(duì)活性則無(wú)明顯變化。 研究結(jié)論 1.胃癌組織中IGFBP3的表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān),IGFBP3表達(dá)高的患者生存期較長(zhǎng)。 2.IGFBP3能顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移侵襲,其作用可能和MMP14, uPA/uPAR等因子相關(guān)。 3.HoxD10可以同IGFBP3啟動(dòng)子區(qū)域的HBS3、HBS4及HBS5結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)IGFBP3的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2421884