【摘要】：背景胃癌是我國發(fā)病率和死亡率排名第三的惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展與信號通路的失調(diào)密切相關(guān)。Hippo-Yap信號通路與消化系統(tǒng)的器官發(fā)育、組織修復有關(guān),而且對胃癌細胞的生存、轉(zhuǎn)移等具有抑制作用,其效應(yīng)元件Yap是治療胃癌的重要靶點。Fat4是Fat鈣黏蛋白家族成員,作為一種單跨膜蛋白受體,與哺乳動物的細胞分化、組織發(fā)育有關(guān)。Fat4可以作為Hippo-Yap通路的上游信號分子轉(zhuǎn)導細胞間的信號,其低表達會造成哺乳動物腎臟、神經(jīng)管以及內(nèi)耳等的發(fā)育缺陷。有研究發(fā)現(xiàn),Fat4還能夠作為腫瘤抑制因子抑制胃癌細胞的增殖與遷移,但是Fat4在許多腫瘤包括胃癌中都存在基因突變導致的蛋白缺失。因此Fat4的缺失有可能與胃癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移能力的改變以及胃癌患者預后有關(guān),并且可能與其參與Hippo-Yap信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān),但是其相關(guān)性及發(fā)生機制尚未闡明。目的研究Fat4的低表達與胃癌細胞的增殖、遷移、耐藥性等生物學行為的相關(guān)性;探討Fat4的表達異常對胃癌細胞中Hippo-Yap信號通路的調(diào)節(jié)機制;明確Fat4的表達與胃癌組織的臨床病理學特征及患者預后之間的相關(guān)性。方法1.1)通過基因干擾技術(shù)(Fat4-shRNA)敲低Fat4在胃癌細胞中的表達,應(yīng)用Western blotting實驗檢測Fat4低表達對Yap、p-Yap、LATS、p-LATS、CyclinD1及c-Myc蛋白表達的影響;2)采用MTT、平板克隆及裸鼠移植瘤實驗檢測Fat4敲低對胃癌細胞增值能力的影響;3)通過流式細胞術(shù)分析Fat4敲低對胃癌細胞周期的影響：4)采用Transwell實驗觀察Fat4敲低對胃癌細胞遷移能力的影響。2.1)通過Western blotting實驗檢測Fat4敲低的胃癌細胞(shFat4細胞)的胞漿蛋白與胞核蛋白中的Yap、p-Yap,β-catenin的蛋白表達水平,以及Yap敲低的胃癌細胞(shYap細胞)中胞漿p-Yap與β-catenin蛋白的表達水平;2)通過qRT-PCR實驗檢測Fat4敲低及Yap敲低的胃癌細胞中Fat4、Yap、 P-catenin的mRNA相對表達水平;3)將Fat4全長基因克隆至胃癌細胞使其過表達(Fat4細胞),或克隆至Fat4細胞(shFat4+Fat4細胞)或shCtrl細胞(shCtrl+Fat4細胞)中,并通過Western blotting實驗檢測Fat4、p-Yap Yap CyclinD1及MMP-7的蛋白表達;同時應(yīng)用流式細胞術(shù)分析上述胃癌細胞的細胞周期;4)通過MTT法檢測Fat4敲低的胃癌細胞在接受5-FU、順鉑、奧沙利鉑和紫杉醇處理后的存活率。3.1)收集122例接受過胃癌D2根治術(shù)治療的患者的蠟塊組織及臨床病理資料：2)用免疫組織化學染色檢測Fat4和Yap蛋白在122例胃癌組織及85例正常胃黏膜組織的表達情況;3)通過Pearson X2檢驗探討Fat4表達量與胃癌臨床病理特征之間的相關(guān)性;4)采用Kaplan-Meier法及Cox回歸風險比例模型分析研究Fat4的表達量與胃癌患者累積生存率的相關(guān)性。結(jié)果1.1) shFat4細胞相對于對照組胃癌細胞(shCtrl細胞),其Fat4蛋白表達水平顯著降低,同時p-Yap及p-LATS的蛋白表達也降低,但是Yap及LATS的蛋白表達沒有改變;2) p-Yap與Yap蛋白水平的比值(p-Yap/Yap)和p-LATS與LATS蛋白水平的比值(p-LATS/LATS)在shFat4胃癌細胞中顯著低于shCtrl細胞：3) shFat4細胞的細胞相對于shCtrl細胞,其細胞活性升高(P0.05),克隆形成數(shù)目增加(P0.05),裸鼠皮下瘤的體積增大、生長速度增快(P0.05)：4) shFat4細胞的細胞相對于shCtrl細胞,其在G1期的比例下降(50.69% vs.30%,P0.05),在G2/M期的比例升高(49.31% vs.70%,P0.05),而且細胞周期蛋白CyclinDl及c-Myc的蛋白表達顯著增加;5) Transwell小室中Fat4敲低的胃癌細胞吸光度值高于shCtrl細胞(1.57 vs.0.65,P0.05); Fat4敲低的胃癌細胞相對于對照組胃癌細胞,其遷移相關(guān)蛋白MMP-7、Cyr61增加而E-cadherin降低。2.1)Fat4敲低的胃癌細胞相對于shCtrl細胞中,胞漿p-Yap蛋白水平降低,胞核Yap蛋白水平升高,但是胞漿Yap蛋白水平不變;2)相對于shCtrl細胞,shFat4細胞或shYap細胞的胞漿蛋白中的p-Yap表達水平降低但P-catenin表達水平升高;shFat4細胞或shYap細胞中的P-catenin mRNA相對表達量與對照組沒有差異;3) shFat4細胞相對于shCtrl細胞,其Fat4、p-Yap蛋白表達降低,CyclinD1及MMP-7蛋白表達升高,但是全長Fat4過表達轉(zhuǎn)染使上述蛋白表達水平出現(xiàn)逆轉(zhuǎn);shFat4細胞相對于shCtrl細胞,其S/G2/M期的胃癌細胞比例增加,但是可以被全長Fat4過表達轉(zhuǎn)染所逆轉(zhuǎn)。4)胃癌細胞接受5-FU、順鉑、奧沙利鉑和紫杉醇處理后,shFat4細胞的細胞生存率高于shCtrl細胞。3.1)胃癌組織中Fat4蛋白的陰性染色顯著高于鄰近非胃癌組織(69% vs.33%,P0.05); Fat4在胃癌組織的陽性表達與胞核Yap的表達呈負相關(guān)(x2=24.0484,P=0.0000);2)Fat4的陰性染色與胃癌的淋巴管侵犯(P=0.0011)、腫瘤浸潤深度(P=0.00166)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0007)呈正相關(guān)：3)Fat4的陰性染色與胃癌患者的累積生存率呈負相關(guān)(P=0.004)。結(jié)論1.Fat4蛋白低表達會導致胃癌細胞內(nèi)p-Yap蛋白減少,并使胃癌細胞的增殖和細胞周期進程加快,以及遷移能力增強;2.Fat4蛋白低表達通過促進Yap及β-catenin蛋白的核轉(zhuǎn)位增加而發(fā)揮增強胃癌細胞的增殖、遷移及化療耐藥的能力。3.Fat4蛋白低表達與胃癌的浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移正相關(guān),與胃癌患者的預后呈負相關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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