【摘要】：前言食管癌(Esophageal cancer)是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一,其典型癥狀表現(xiàn)為進(jìn)行性咽下困難,根據(jù)病理組織學(xué)分型,食管癌可分為鱗癌、腺癌和腺鱗癌。在所有的惡性腫瘤中,食管癌的致死率居于第六位,盡管隨著腫瘤治療手段的進(jìn)步,食管癌的5年生存率較30年前有了顯著提高(約4%),達(dá)到10%-20%,但其生存率仍處于較低水平。食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinomas, ESCC)是最常見(jiàn)的消化道侵襲性惡性腫瘤之一,預(yù)后較差,研究發(fā)現(xiàn)鱗癌與腺癌的生存率之間無(wú)明顯差異。目前,治療ESCC的常規(guī)有效的方法主要包括手術(shù)治療、放療及化療,其中手術(shù)治療最為常用。至今為止,盡管多種治療方法已經(jīng)應(yīng)用于ESCC的治療,但其五年生存率仍不能令人滿意。因此,發(fā)現(xiàn)一種可預(yù)測(cè)ESCC預(yù)后的生物標(biāo)志物在ESCC的治療方面將具有重大的意義,并可用于在高危人群中篩查ESCC患者。所以,對(duì)ESCC分子機(jī)制的研究將有助于對(duì)ESCC患者的治療。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (Transforming growth factor-β, TGF-p)是一種多功能生長(zhǎng)因子,主要由腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生,可作為一種重要的炎癥因子,在維持上皮細(xì)胞的穩(wěn)定過(guò)程中起著重要的作用,同時(shí)對(duì)于許多重要的細(xì)胞過(guò)程也起著重要的調(diào)節(jié)作用,包括細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成等過(guò)程。TGF-β的一個(gè)最主要的作用是抑制細(xì)胞增殖,因此TGF-β功能異常與多種腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系,例如結(jié)腸癌、膀胱癌、卵巢癌、。腎癌、淋巴瘤、上皮細(xì)胞癌等。在正常的上皮細(xì)胞中,TGF-β可誘導(dǎo)G1周期的可逆性停滯,而在上皮細(xì)胞癌細(xì)胞中,TGF-β的功能明顯被抑制。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β在食管鱗癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。絲氨酸／精氨酸蛋白激酶(serine-arginine protein kinase, SRPK)是一類(lèi)能特異性磷酸化RNA剪接子內(nèi)精氨酸-絲氨酸結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶,可與精氨酸-絲氨酸或絲氨酸-精氨酸二肽模體特異性結(jié)合,在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在人體內(nèi),SRPK主要分為兩種亞型,即SRPK1及SRPK2,這兩種亞型主要分布在不同的組織器官之中,調(diào)節(jié)絲氨酸-精氨酸蛋白與mRNA前體的特異性結(jié)合,保證細(xì)胞的正常功能,同時(shí)在細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。SRPK1是真核生物中一種高度保守的蛋白質(zhì),由一個(gè)PKC超家族激酶域和一個(gè)將該激酶域平均分為兩部分的間隔區(qū)組成。一些研究表明SRPK1在富含絲氨酸／精氨酸序列的蛋白質(zhì)(又稱(chēng)為RS-域蛋白)的特定氨基酸序列的磷酸化過(guò)程中起著重要的作用。RS-域蛋白主要作用于前體mRNA的翻譯、加工、剪切,染色體的重建,細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重構(gòu)等過(guò)程。SRPK1的間隔區(qū)可參與SRPK1由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。研究表明,SRPK1表達(dá)水平的提高與乳腺癌、肺癌及肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),SRPK1對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲、遷移也具有重要的作用。但是SRPK1在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制仍有待研究。根據(jù)目前的研究結(jié)果,本組認(rèn)為沉默SRPK1基因的表達(dá)在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中可發(fā)揮抗腫瘤的作用。然而,到目前為止,TGF-β-SRPK1在ESCC中的確切作用仍不清楚。為探究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的作用和意義,我們應(yīng)用免疫組化法、免疫印跡法及RT-PCR法檢測(cè)120例食管鱗狀細(xì)胞癌樣本及細(xì)胞系中SRPK1的表達(dá)水平。并在體外實(shí)驗(yàn)中,檢測(cè)加入TGF-β作用后的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的SRPK1的表達(dá)水平,從而分析并總結(jié)SRPK1在ESCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜及其生物學(xué)作用,著重于探究發(fā)展有效的抗-SRPK1治療方法的臨床價(jià)值和優(yōu)勢(shì)。第一部分S RPK1在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義目的本研究通過(guò)應(yīng)用免疫組織化學(xué)以及基因和蛋白檢測(cè)方法觀察SRPK1在食管癌組織及正常食管組織中的表達(dá),并分析其在食管癌發(fā)生和發(fā)展及腫瘤轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期中的關(guān)系,探討SRPK1可能作為致癌基因在食管癌的診斷和治療的臨床價(jià)值,為其治療提供新的靶點(diǎn)。材料與方法本實(shí)驗(yàn)選取山東省腫瘤醫(yī)院及山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科自2008年10月至2010年6月收治的120例食管癌病人,病人均經(jīng)過(guò)手術(shù)治療,切除的食管癌標(biāo)本經(jīng)兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立診斷證實(shí)。標(biāo)本中癌組織作為實(shí)驗(yàn)組,相應(yīng)標(biāo)本的上切緣組織即距腫瘤5cm以上的正常食管組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組進(jìn)行配對(duì)分組研究。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SRPK1蛋白在食管癌組織及與其配對(duì)正常組織中表達(dá)的差異,探討其在腫瘤演生、進(jìn)展過(guò)程中的作用。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,SRPK1與食管癌臨床病理因素之間的分析采用行卡方檢驗(yàn)。以a=0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果：1.SRP K1在ESCC組織中的表達(dá)免疫組化染色表明,在120例ESCC組織中,有65例顯示了高SRPK1表達(dá),而在這65例ESCC組織中,SRPK1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá),其中包括29例(++)和31例(+++)。然而,在癌周正常組織中則很少出現(xiàn)SRPK1染色。此外,SRPK1 mRNA的表達(dá)水平在腫瘤組織中明顯增高。與無(wú)癌轉(zhuǎn)移的食管組織相比,在有癌轉(zhuǎn)移的ESCC樣本中SRPK1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。2. SRPK1與腫瘤臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系SRPK1的表達(dá)與腫瘤臨床分期及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性。相反,SRPK1的表達(dá)量與ESCC的轉(zhuǎn)移之間具有顯著相關(guān)性,其差異具有的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。3.SRPK1表達(dá)水平與ESCC病人預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存曲線顯示SRPK1表達(dá)水平與總生存率偏低密切相關(guān)(p0.000)。另外,單因素分析結(jié)果證實(shí),SRPK1高表達(dá)的病人發(fā)生死亡的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高(p0.001)。同時(shí),單因素分析結(jié)果還顯示,ESCC轉(zhuǎn)移性與不良預(yù)后有關(guān),然而,患者的年齡、性別和腫瘤侵襲深度與預(yù)后之間無(wú)關(guān)聯(lián)。多因素分析結(jié)果也顯示,SRPK1表達(dá)可作為預(yù)測(cè)ESCC病人預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(p0.001)結(jié)論：SRPK1蛋白在食管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常食管組織。SRPK1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性,與ESC C的轉(zhuǎn)移之間具有顯著相關(guān)性。SRPK1表達(dá)水平與總生存率偏低密切相關(guān),且高表達(dá)的ESCC患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增高,因此,SRPK1的表達(dá)可作為預(yù)測(cè)ESCC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。第二部分SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞的增殖和凋亡中的作用目 的：1.研究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系的表達(dá)水平。2.研究SRPK1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中的作用和意義。3.探究SRP K1在TGF-β介導(dǎo)的食管鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中的生物學(xué)作用。材料方法：1. SRPK1-WT 及 SRPK1-KD質(zhì)粒和腺病毒載體的構(gòu)建建立人ESCC細(xì)胞系EC109、TE8和TE2細(xì)胞,以進(jìn)行相關(guān)的SRPK1的細(xì)胞水平檢測(cè)。野生型SRPK1 (SRPK1-WT)的全長(zhǎng)cDNA通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增正常食管上皮細(xì)胞mRNA獲得,而SRPK1 (SRPK1-KD)無(wú)活性激酶突變體則通過(guò)將第109位的賴(lài)氨酸催化突變?yōu)楸彼岖@得。隨后,將SRPK1-WT或者SRPK1-KD的cDNA插入pcDNA3.1 (-)A-myc/his表達(dá)載體。通過(guò)AdEasyTM XL腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建腺病毒表達(dá)SRPK-WT 或 SRPK1-KD。2.抗SRPK1質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和siRNA均以脂質(zhì)體2000為載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用Western b lot及RT-PCR方法分別檢測(cè)EC109、TE8和TE2細(xì)胞系中SRPK1的表達(dá),同時(shí)還應(yīng)用、Vestern blot法檢測(cè)細(xì)胞中AKT和JNK的磷酸化水平,從而評(píng)估SRPK1對(duì)TGF-β信號(hào)通路的潛在作用。3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)檢測(cè)SRPK1野生型及激酶失活型細(xì)胞的生存率,以探究SRPK1對(duì)細(xì)胞增殖的影響。4.采用TUNEL實(shí)驗(yàn)和免疫印跡方法探究SRPK1對(duì)ESCC細(xì)胞凋亡的影響。并設(shè)計(jì)損傷愈合實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)以探究SRPK1在EC109細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程的作用。5.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和、Western blot法選擇EC109細(xì)胞系來(lái)研究SRPK1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用及對(duì)調(diào)控因子的表達(dá)的影響。結(jié)果：1.SRPK1在ESCC細(xì)胞中的表達(dá)在不同的細(xì)胞系中SRPK1的表達(dá)水平有所不同。SRPK1在TE2細(xì)胞系中表達(dá)水平最高,在EC109細(xì)胞系中表達(dá)水平最低。在EC109、TE8和TE2細(xì)胞系中,SRPK1主要在細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。2. SRPK1影響細(xì)胞增殖野生型S RP Kl可增強(qiáng)三種ESCC細(xì)胞系細(xì)胞的增殖作用,而激酶失活型則可抑制細(xì)胞增殖。同時(shí),SRPK1基因沉默可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。3. SRPK1影響細(xì)胞凋亡SRPK1基因敲除的陽(yáng)性細(xì)胞中,活化-caspase3和cyclinD1的表達(dá)水平升高,而在對(duì)照siRM A組則無(wú)增高(p0.01)。同時(shí),經(jīng)si-SRP K1治療后,EC 109細(xì)胞可出現(xiàn)凋亡相關(guān)的形態(tài)變化,如細(xì)胞萎縮變圓、細(xì)胞膜空泡化、細(xì)胞核斷裂凝結(jié)等。在TE8和TE2等其他ESCC細(xì)胞系中,si-SRPK1作用后的細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)相同的變化。4. SRPK1調(diào)節(jié)AKT和JNK信號(hào)與對(duì)照siRNA組相比,在si-SRPK1處理組,磷酸化-AKT在三種ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平均顯著降低(p0.01),而磷酸化-JNK的表達(dá)水平則明顯增高(p0.01)。5. SRPK1調(diào)控ESCC細(xì)胞的細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程EC109細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)化的過(guò)程受到SRPK1 siRNA的抑制。同時(shí),與對(duì)照組相比,ESCC細(xì)胞中的cyclin D1和CDK2的表達(dá)水平也受到明顯抑制。損傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示,SRPK1 siRNA轉(zhuǎn)染后的EC 109細(xì)胞的遷移性下降明顯。同樣,在侵襲實(shí)驗(yàn)中,與未轉(zhuǎn)染組相比,SRPK1 siRNA轉(zhuǎn)染后的EC109細(xì)胞的侵襲性也受到明顯的抑制(p0.001)。結(jié)論：SRPK1在不同分化水平的ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平有所不同,提示SRPK1在ESCC的發(fā)展中有一定的作用,且對(duì)細(xì)胞信號(hào)的起始和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程有一定的影響。SRPK1可通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)通路的活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡,為T(mén)GF-β信號(hào)通路的一個(gè)重要組成部分。SRPK1亦可調(diào)控ESCC細(xì)胞的細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程,作為G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2420427