【摘要】：研究背景與目的在世界范圍內(nèi),乳腺癌公認(rèn)是最為常見的女性惡性腫瘤。在東亞地區(qū),女性人群中乳腺癌的發(fā)生率僅次于胃癌。更甚于在中國部分地區(qū),其發(fā)生率以每年3-4%的速度遞增,這個水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界增長水平,其現(xiàn)狀令人堪憂。乳腺癌患者除了以乳腺腫塊為主訴進(jìn)行就醫(yī)以外,乳頭溢液成為另一個不可忽視的乳腺癌臨床癥狀。而且有文獻(xiàn)報道,除乳腺腫塊和乳房疼痛這兩大常見主訴,乳腺相關(guān)科室大約有5%的患者因乳頭溢液前來醫(yī)療問詢。目前臨床需要一種高效的診斷工具來輔助乳腺導(dǎo)管造影術(shù)和乳頭溢液脫落細(xì)胞學(xué)檢查,對乳頭溢液進(jìn)行檢測來篩查良惡性乳腺疾病。乳頭溢液中所包含的眾多成分就可以作為臨床檢測的一個契機(jī),以此來對乳頭溢液的良惡性進(jìn)行初步診斷。乳頭溢液中腫瘤標(biāo)記物的水平可以輔助診斷不同乳腺疾病。目前臨床上常用的與癌癥相關(guān)的血清腫瘤標(biāo)記物為癌胚抗原(CEA)、癌相關(guān)抗原153(CA153)、癌相關(guān)抗原125(CA125)、癌相關(guān)抗原199(CA199)、癌相關(guān)抗原724(CA724)和甲胎蛋白(AFP),以上腫瘤標(biāo)記物均為糖蛋白,在癌癥發(fā)展過程中改變其多糖鏈結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致相應(yīng)腫瘤標(biāo)記物的水平升高。前期文獻(xiàn)報道乳腺癌患者血清中CEA水平較高,是一種不良預(yù)后的信號并且和癌癥的進(jìn)展期相關(guān)。另外也有相關(guān)文獻(xiàn)得出結(jié)論,CEA對于乳腺癌患者的術(shù)后隨訪、復(fù)發(fā)的早期診斷以及對術(shù)后輔助治療的反應(yīng)均有意義。與CEA相似,高水平表達(dá)的CA153在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。CA153還是癌癥復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因素以及對晚期乳腺癌患者的重要預(yù)后指標(biāo)。另Lakshmanan I研究表明CA125在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),并且在無瘤乳腺導(dǎo)管內(nèi)不表達(dá)。CA 199與多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移也有密切關(guān)系。另有文獻(xiàn)稱在乳腺癌患者血清中可以檢測到高水平CA199。文獻(xiàn)報道AFP也是乳腺癌發(fā)生的一種危險因素。在乳腺癌患者血清中可以檢測到高水平AFP。有前期文獻(xiàn)表明,CA724聯(lián)合CEA、CA199能夠提高檢測的靈敏度。miRNAs是一種微小的、非編碼的單鏈RNA,是由18到22個核苷酸組成。miRNA在人體最基本的生物過程中發(fā)揮重要作用,其中包括：發(fā)育、分化、凋亡及增殖,而且作為翻譯后修飾調(diào)節(jié)因子可降解目的mRNA或者抑制mRNA翻譯。文獻(xiàn)表明miRNA的異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。并且一部分miRNA被證實在乳腺癌中水平升高或者降低,如miRNA 92a、miRNA 21等。這種趨勢就推動本研究去把miRNA當(dāng)做一種腫瘤標(biāo)記物來研究,探索在伴隨乳頭溢液的乳腺癌中相關(guān)miRNA所發(fā)揮的重要作用。文獻(xiàn)中表明人類體液中miRNA可以抵抗核糖核酸酶的降解作用,并且可以作為檢測相關(guān)癌癥的腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行臨床應(yīng)用。但是,目前并沒有相關(guān)文獻(xiàn)研究證實乳頭溢液中是否存在miRNA,或者是伴隨乳頭溢液的乳腺癌與特定miRNA水平之間的關(guān)系研究。乳頭溢液檢查有眾多優(yōu)勢,如取材快速、無創(chuàng)檢查、溢液中目的成分濃度高等,方便臨床應(yīng)用。乳頭溢液中腫瘤標(biāo)記物的檢測對診斷良性與惡性乳腺疾病有較好的預(yù)測能力。本論文研究的主要目的在于探討人乳頭溢液中及乳汁中糖蛋白類腫瘤標(biāo)記物CEA、CA153及CA125等濃度與不同乳腺疾病的關(guān)系,并且比較腫瘤標(biāo)記物及其他臨床病理指標(biāo)與乳腺疾病最終診斷之間的聯(lián)系。本研究首次檢測乳頭溢液中miRNA水平,探討miRNA作為乳頭溢液中腫瘤標(biāo)記物的可行性。由于miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用,本課題擬對miRNA在乳腺癌中的表達(dá)及對乳腺癌細(xì)胞活性的作用做進(jìn)一步研究。并希望能夠通過腫瘤標(biāo)記物水平測定,為伴隨乳頭溢液的乳腺癌的診斷、治療及預(yù)防提供新的思路,對于其早期診斷、療效監(jiān)測等方面都有重要意義。材料與方法第一部分,用于糖蛋白類腫瘤標(biāo)記物檢測的336例乳頭溢液標(biāo)本取自2012年2月至2015年5月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院乳腺外科入院患者。336例乳頭溢液標(biāo)本包括：96例乳腺癌(35例浸潤性導(dǎo)管癌[IDC],29例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌[IPC]和32例導(dǎo)管內(nèi)原位癌[DCIS])以及240例良性乳腺疾病(182例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤[IDP]和58例導(dǎo)管擴(kuò)張癥[MDE])。收集56例健康產(chǎn)婦初乳為健康對照。所有標(biāo)本使用三明治式電化學(xué)免疫發(fā)光分析法(ECLIA)進(jìn)行腫瘤標(biāo)記物檢測,對健康對照組、良性乳腺疾病組和乳腺癌組進(jìn)行數(shù)據(jù)比較。運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)分析可能發(fā)生乳腺癌的危險因素。第二部分,收集6例臨床患者乳頭溢液進(jìn)行microRNA微陣列分析(miRNA microarray)篩選,選取在乳腺癌組中表達(dá)突出的miRNA,再次對21例乳頭溢液標(biāo)本進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗證及反應(yīng)產(chǎn)物的測序分析。選用不同亞型的乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺細(xì)胞系進(jìn)行目的miRNA(miR-4732-5p)水平測定。并在配對臨床標(biāo)本(乳腺癌組織及其癌旁組織)再次進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗證。并對miR-4732-5p進(jìn)行一系列綜合實驗,包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、RNA過表達(dá)、MTT比色法、Annexin V-FIFC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡等。對miR-4732-5p影響不同亞型乳腺癌細(xì)胞系遷移、增殖、凋亡等細(xì)胞活性的作用進(jìn)行了研究分析。根據(jù)miRNA-4732-5p下游基因預(yù)測結(jié)果,對乳腺癌細(xì)胞系和乳腺組織進(jìn)行目的基因檢測,確認(rèn)基因表達(dá)水平。上述研究構(gòu)成了一整個體系,研究乳頭溢液中糖蛋白類腫瘤標(biāo)記物和miRNA與乳腺癌之間的關(guān)系。本研究中所有P值均為雙向,且P值小于0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.乳頭溢液中糖蛋白類腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)(1)CEA和CA153在區(qū)分良惡性乳頭溢液上有臨床意義,CA 125的測定水平在乳腺癌組和良性疾病組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P值為0.397)。CEA、CA 153和CA125對應(yīng)的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.827、0.706、0.464。CEA作為腫瘤標(biāo)記物用來區(qū)分良惡性乳腺疾病的分界值是263.3 ng/mL,相對應(yīng)的特異度和靈敏度分別是88.4%和62.5%。CA153作為腫瘤標(biāo)記物用來區(qū)分良惡性乳腺疾病的分界值是1235.3 U/mL,相對應(yīng)的特異度和靈敏度分別是71.6%和62.4%。(2)CA199和AFP在良惡性乳腺疾病中表達(dá)無差異,雖然CA724在乳腺癌組的表達(dá)趨勢高于良性乳腺疾病組,根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算乳頭溢液中CA199、CA724及AFP并不能區(qū)別良惡性乳腺疾病,其P值均大于0.05。(3)乳汁與乳頭溢液中的CEA、CA153和CA125表達(dá)有差異。乳腺癌患者乳頭溢液中的CEA、CA153和CA125的表達(dá)水平要明顯高于健康對照組和良性乳腺疾病組(P值均明顯小于0.001)。將乳腺癌組患者和健康對照組進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者一組中乳頭溢液中CEA、CA153和CA125的中位水平分別相較于對照組升高了38.7倍、3.9倍和7倍。良性疾病患者的乳頭溢液中CEA和CA125的水平明顯高于健康對照組,而CA153并沒有表現(xiàn)如此趨勢。2.乳頭溢液中的miRNA的篩檢與miR-4732-5p的功能研究(1)在微陣列分析篩選過程所包含的3100種人]miRNA中,共有10種miRNA的表達(dá)水平在兩組數(shù)據(jù)比較中存在明顯差異。其中miR-4732-5p、miR-4687-3p和miR-S1-5p在乳腺癌組明顯低表達(dá),具有統(tǒng)計學(xué)意義。除外miR-S1-5p,所有經(jīng)驗證的乳頭溢液miRNA (miR-4732-5p和niR-4687-3p)表達(dá)水平均使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測得。miR-4732-5p在驗證實驗中保持結(jié)果一致性,乳腺癌組的表達(dá)遠(yuǎn)低于良性對照組。(2)miR-4732-5p在不同亞型乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于正常乳腺細(xì)胞系：本研究將8種不同亞型的乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、 MDA-MB-453、MDA-MB-157、MDA-MB-231、ZR-75-1、SK-BR-3、 BT549、T47D)和人類正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A分別進(jìn)行miR-4732-5p的實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)重復(fù)實驗測定,8種乳腺癌細(xì)胞系的miR-4732-5p的表達(dá)均明顯低于人類正常乳腺癌細(xì)胞系MCF-10A。(3)miR-4732-5p在配對乳腺癌組織和癌旁組織中表達(dá)有差異：所有入組成對標(biāo)本中, 有78.6%的乳腺癌組織中所表達(dá)的miR-4732-5p低于對應(yīng)的癌旁組織。并根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果分析：在所有乳腺癌患者中,臨床分期越晚,miR-4732-5p表達(dá)水平越高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的乳腺癌組織中miR-4732-5p表達(dá)水平越高,且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的升高,miR-4732-5p表達(dá)水平升高。(4)miR-4732-5p影響乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞活性：在不同亞型乳腺癌細(xì)胞系(MD-MB-231及T47D)中,過表達(dá)的miR-4732-5p對乳腺癌細(xì)胞的遷移和增殖有明顯抑制作用,具有統(tǒng)計學(xué)意義,過表達(dá)miR-4732-5p對乳腺癌細(xì)胞的凋亡并不具有明顯抑制作用。(5)miR-4732-5p的下游基因檢測：通過對]miR-4732-5p下游基因預(yù)測,將備選目的基因ALKBH5、ANKRD 17、BCLAF1、CPSF6、 NHLH1、PPM1E、PSMA5分別在不同亞型乳腺癌細(xì)胞系中及配對臨床乳腺癌和癌旁組織中進(jìn)行檢測,ALKBH5、NHLH1、PPM1E、PSMA5可能為miR-4732-5p下游目的基因,且miR-4732-5p與下游目的基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論1.乳頭溢液中的CEA、CA153和CA125檢測水平大大高于乳汁,支持臨床上乳頭溢液為病理性溢液。2.乳頭溢液中CEA和CA153檢測有助于臨床鑒別診斷乳腺良惡性疾病,可作為乳頭溢液疾病的臨床檢查,有推廣價值。3.乳頭溢液中CA125等其他糖蛋白類標(biāo)志物檢測對鑒別診斷乳腺良惡性疾病作用不大。4.良、惡性乳腺疾病所致乳頭溢液中存在某些特異miRNA表達(dá)的差異,其中miR-4732-5p在乳腺癌組的表達(dá)遠(yuǎn)低于良性對照組。5.miR-4732-5p在乳腺癌組織中及多種乳腺癌細(xì)胞系中均為低表達(dá)；miR-4732-5p對乳腺癌細(xì)胞的遷移和增殖具有抑制作用；其有可能成為乳腺癌治療研究的新靶點。意義1.目前臨床需要一種高效的診斷方法來輔助乳腺導(dǎo)管造影術(shù)和乳頭溢液脫落細(xì)胞學(xué)檢查,對乳頭溢液進(jìn)行臨床前期檢測并篩查良惡性乳腺疾病。乳頭溢液中CEA和CA153的水平測定可作為常規(guī)檢驗輔助診斷不同乳腺疾病,并已在臨床工作中進(jìn)行推廣。.乳頭溢液中miRNA的篩檢和實驗驗證,miR-4732-5p在乳腺癌中的低表達(dá)可區(qū)別良惡性乳頭溢液。其作為腫瘤標(biāo)記物有重大臨床意義,miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用。2.乳頭溢液中糖蛋白類腫瘤標(biāo)記物及miRNAs在良惡性乳腺疾病之間的表達(dá)差異,CEA和CA153及其他臨床病理指標(biāo)與乳腺疾病最終診斷之間的聯(lián)系,均有助于理解乳腺疾病的發(fā)生和發(fā)展。人乳頭溢液及乳汁中腫瘤標(biāo)記物CEA、CA153及CA125濃度差異,在理論上證實了生理性與病理性乳頭溢液的差異。3.對miRNA在乳腺癌作用機(jī)制上有更深刻的了解,miR-4732-5p有可能作為乳腺癌診療研究的新靶點。通過miRNA水平測定,為伴隨乳頭溢液的乳腺癌的診斷、治療及預(yù)防提供新的思路,對于其早期診斷、療效監(jiān)測等方面都有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2419605