【摘要】：第一部分 DNA胞嘧啶修飾堿基含量變化與小肝癌臨床預(yù)后關(guān)系研究目的:探索新型肝癌分子診斷標(biāo)志物,對(duì)及早發(fā)現(xiàn)和規(guī)范治療及改善肝癌預(yù)后具有重要意義。本研究目標(biāo)為闡明小肝癌DNA胞嘧啶修飾堿基含量變化與小肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系,為小肝癌治療及生存預(yù)后提供評(píng)價(jià)依據(jù)。方法:本研究所有病例均符合入組標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)用質(zhì)譜檢測(cè)63例小肝癌基因組DNA胞嘧啶修飾堿基5m C、5hm C、5f C含量;應(yīng)用免疫組化檢測(cè)66例小肝癌5hm C含量及CD133、CD44、CK19、OV6、Ep CAM等肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá),比較分析與臨床病理因素、生存預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:1、質(zhì)譜分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)癌組織基因組DNA中5m C、5hm C、5f C含量較癌旁組織明顯下降(P0.05),相關(guān)性分析顯示癌5m C含量與癌5hm C含量、癌5hm C含量與癌5f C含量呈正相關(guān)性(P0.05)。病理因素關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)癌5m C含量與血HBV-DNA含量,癌旁5m C含量與AFP、微血管癌栓、腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05);癌5hm C含量與生存時(shí)間、血HBV-DNA含量,癌旁5hm C含量與腫瘤轉(zhuǎn)移、AFP、生存時(shí)間,癌組織5hm C/癌旁5hm C與T分期、微血管癌栓、血HBV-DNA含量有關(guān)(P0.05);癌組織5f C含量與腫瘤大小、AFP、生存時(shí)間,癌旁5f C含量與肝硬化,癌組織5f C/癌旁組織5f C與微血管癌栓、T分期有關(guān)(P0.05);癌組織HBV-DNA含量與肝硬化有關(guān)(P0.05),與其他病理因素?zé)o關(guān)。預(yù)后生存單因素分析顯示癌5hm C含量、癌5hm C含量/癌旁5hm C、癌5f C含量、術(shù)后復(fù)發(fā)、腫瘤包膜、微血管癌栓、Child-Pugh分級(jí)、T分期與小肝癌患者無病生存期、總生存期有關(guān),另外血HBV-DNA也與無病生存期有關(guān)(P0.05);COX多因素分析表明癌5hm C含量、術(shù)后復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移是小肝癌患者無病生存期、總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素,微血管癌栓也是總體生存期獨(dú)立預(yù)后因素之一(P0.05)。肝癌細(xì)胞系DNA堿基修飾含量具有差異性,乙肝陽性的肝癌細(xì)胞5m C、5hm C、5f C含量低于乙肝陰性細(xì)胞。2.免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)癌旁5hm C含量、CK19表達(dá)明顯高于癌組織(P0.05);CD133、CD44、OV6、Ep CAM肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物在癌及癌旁組織中整體表達(dá)水平低,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在小樣本分析中,近癌旁組織中CK19的表達(dá)陽性細(xì)胞中5hm C染色陽性的細(xì)胞數(shù)量越多,發(fā)生轉(zhuǎn)移可能性越高、死亡率也越高(P0.05)且無病生存時(shí)間、總體生存時(shí)間也越短(P0.01),預(yù)后越差。但擴(kuò)大樣本后與無病生存時(shí)間、總體生存時(shí)間無關(guān)。結(jié)論:小肝癌5hm C、5f C含量與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存預(yù)后密切相關(guān),癌中DNA胞嘧啶修飾堿基含量可能作為小肝癌復(fù)發(fā)、預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物,具有重要的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值,值得進(jìn)一步深入研究。第二部分IRAK1在肝癌細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞周期中的作用研究目的:基于前期研究發(fā)現(xiàn)IRAK1在肝癌及肝癌細(xì)胞系中明顯升高及在不同位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)及水平的差異,預(yù)示IRAK1在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。本研究通過運(yùn)用IRAK1的磷酸化抑制劑,研究了抑制IRAK1活性對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及裸鼠皮下瘤體生長等生物學(xué)功能中的作用及機(jī)制,揭示靶向IRAK1在肝癌治療中的重要作用。方法:1.分別采用免疫組化法、Western Blot技術(shù)檢測(cè)人肝癌組織、癌旁組織及肝癌細(xì)胞系中p-IRAK1表達(dá)水平。2.應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)IRAK1/4小分子抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞系中IRAK1、p-IRAK1表達(dá)水平的影響;探索不同劑量IRAK1/4小分子抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞系IRAK1、p-IRAK1(T209)的作用效果。3.采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)研究IRAK1/4小分子抑制劑抑制p-IRAK1的磷酸化水平后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。4.運(yùn)用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)研究抑制p-IRAK1水平后對(duì)肝癌細(xì)胞的粘附、遷移能力的影響。5.運(yùn)用AnnexinV和PI染色聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù),觀察IRAK1/4小分子抑制劑下調(diào)p-IRAK1(T209)的磷酸化水平時(shí)肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化情況。6.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究IRAK1/4小分子抑制劑對(duì)小鼠皮下肝癌荷瘤的生長情況的影響作用,運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)肝癌皮下肝癌荷瘤增殖因子變化情況。結(jié)果:1.通過免疫組化檢測(cè)p-IRAK1(T209)在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織;Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示各種肝癌細(xì)胞系的p-IRAK1(T209)表達(dá)水平也比肝正常細(xì)胞系高。2.Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,IRAK1/4抑制劑能明顯下調(diào)多種肝癌細(xì)胞系中p-IRAK1(T209)水平,并且其下調(diào)水平與抑制劑濃度呈正相關(guān),20um IRAK1/4抑制劑是較理想抑制劑量,而p-IRAK1(S376)、IRAK1總體水平變化不明顯。3.IRAK1/4抑制劑可通過下調(diào)p-IRAK1(T209),有效抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移能力,降低肝癌細(xì)胞的克隆水平。4.IRAK1/4抑制劑下調(diào)肝癌細(xì)胞p-IRAK1(T209)水平后,可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,引起肝癌細(xì)胞周期阻滯。5.IRAK1/4抑制劑能明顯抑制肝癌皮下荷瘤的生長,與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:驗(yàn)證了肝癌細(xì)胞靶向IRAK1通過p-IRAK1(T209)的水平及狀態(tài)改變來調(diào)控肝癌細(xì)胞遷移、增殖、凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)功能;進(jìn)一步證實(shí)了IRAK1/4小分子抑制劑可通過抑制p-IRAK1(T209)水平進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖及腫瘤生長的重要作用;初步表明IRAK1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用可能與IRAK1磷酸化水平密切相關(guān),為IRAK1肝癌靶向治療提供了新的治療理論基礎(chǔ)和實(shí)踐證明。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2418334