【摘要】：目的:研究γδT細(xì)胞對(duì)MM(multiple myeloma,骨髓瘤)細(xì)胞的殺傷作用和對(duì)im DCs(immature dendritic cells,未成熟樹突狀細(xì)胞)轉(zhuǎn)分化為OCs(osteoclast cells,破骨細(xì)胞)的抑制作用。方法:(1)采集健康志愿者外周血,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離獲得PBMNCs(peripheral blood mononuclear cells,外周血單個(gè)核細(xì)胞),并在1μM Zol(zoledronate,唑來(lái)膦酸)和200 IU/ml rh IL-2(recombinant human interleukin-2,重組人白介素-2)的條件下擴(kuò)增獲得γδT細(xì)胞,免疫磁珠法分選培養(yǎng)至第7天的γδT細(xì)胞;(2)收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MM 8226細(xì)胞株,與磁珠分選獲得的γδT細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí),通過(guò)LDH(lactate dehydrogenase,乳酸脫氫酶)法檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)MM 8226細(xì)胞株的殺傷作用;并比較分別用10μg/ml抗人γδTCR m Ab(monoclonal antibody,單克隆抗體)、抗人NKG2D m Ab、抗人γδTCR m Ab+抗人NKG2D m Ab及抗鼠Ig G m Ab封閉后的γδT細(xì)胞對(duì)MM 8226細(xì)胞株的殺傷作用;(3)免疫磁珠法分選獲得CD14+單個(gè)核細(xì)胞,在rh IL-4(recombinant human interleukin-4,重組人白介素-4)和GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的作用下分化為im DCs,后者在M-CSF(macrophage colony stimulating factor,巨噬細(xì)胞集落刺激因子)和s RANKL(soluble nuclear factor kappa B predominate ligand receptor activation factors,可溶性細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體)共同作用下轉(zhuǎn)分化為具有骨吸收作用的OCs;(4)免疫磁珠分選獲得的γδT細(xì)胞與CD14+單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)im DCs途徑轉(zhuǎn)分化為OCs的各個(gè)階段,通過(guò)直接和間接接觸的方式以不同比例共培養(yǎng)至第14天,通過(guò)TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase,抗酒石酸酸性磷酸酶)染色觀察γδT細(xì)胞對(duì)OCs生成數(shù)量的影響;(5)將抗體封閉后的γδT細(xì)胞與im DCs以10:1的比例直接共培養(yǎng)至第14天,通過(guò)TRAP染色觀察生成OCs的情況;(6)收集不同培養(yǎng)組上清液,通過(guò)ELISA方法檢測(cè)不同階段、不同比例上清液中IFN-γ(interferon-γ,干擾素-γ)和CTX-I(Type I collagen end Carboxy-terminal peptide,I型膠原C-末端肽)濃度變化。結(jié)果:(1)證實(shí)體外條件下可通過(guò)Zol和IL-2擴(kuò)增獲得γδT細(xì)胞;(2)γδT細(xì)胞與MM 8226細(xì)胞株按效靶比為10:1、1:1、1:10混合培養(yǎng)4小時(shí),γδT細(xì)胞對(duì)其殺傷率分別為41.69%、26.88%、9.97%,顯示γδT細(xì)胞對(duì)MM細(xì)胞具有殺傷作用,且呈劑量依賴性;分別用抗人γδTCR m Ab、抗人NKG2D m Ab、抗人γδTCR m Ab+抗人NKG2D m Ab及抗鼠Ig G m Ab封閉γδT細(xì)胞后,將γδT細(xì)胞與MM 8226細(xì)胞株按10:1的效靶比混合培養(yǎng)時(shí),各組殺傷率分別為21.56%、26.86%、14.93%、42.03%,顯示TCR-γδ途徑被阻斷后,γδT細(xì)胞對(duì)MM 8226細(xì)胞株的殺傷力減低,且比NKG2D途徑阻斷后的殺傷率減低更明顯;(3)γδT細(xì)胞與CD14+PBMNCs直接共培養(yǎng)組中基本見不到TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞;間接共培養(yǎng)組中,當(dāng)兩者比例為1:5時(shí),TRAP染色陽(yáng)性多核巨細(xì)胞數(shù)為8.33±2.08(x±S)個(gè)/10個(gè)視野,遠(yuǎn)低于CD14+PBMNCs單獨(dú)培養(yǎng)組(37.67±2.05個(gè)/10個(gè)視野)(p0.05);γδT細(xì)胞與im DCs直接共培養(yǎng)組中,兩者比例分別為1:10、1:1、10:1時(shí),TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞數(shù)目分別為14.33±2.08個(gè)/10個(gè)視野、9.67±2.52個(gè)/10個(gè)視野、3.33±1.53個(gè)/10個(gè)視野,各組之間以及與im DCs單獨(dú)培養(yǎng)組(37.67±2.05個(gè)/10個(gè)視野)之間比較,OCs均生成減少(p值均小于0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在γδT細(xì)胞與im DCs間接共培養(yǎng)組中,兩者比例分別為1:10、1:1、10:1時(shí),TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞數(shù)目分別為24.67±2.08個(gè)/10個(gè)視野、15.53±1.33個(gè)/10個(gè)視野、7.67±0.58個(gè)/10個(gè)視野,各組與im DCs單獨(dú)培養(yǎng)組之間差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均小于0.05);γδT細(xì)胞與OCs直接或間接共培養(yǎng)組中,均可見到已經(jīng)生成的OCs被溶解、皺縮,并顯示相同比例的兩種細(xì)胞共培養(yǎng),直接混合培養(yǎng)相對(duì)間接共培養(yǎng),γδT細(xì)胞對(duì)各個(gè)階段的抑制作用更明顯;并且,γδT細(xì)胞對(duì)im DCs轉(zhuǎn)分化為OCs過(guò)程中的抑制作用呈劑量依賴性,隨著γδT細(xì)胞比例的增高,其抑制作用相對(duì)更明顯;(4)抗人γδTCR m Ab、抗人NKG2D m Ab、抗人γδTCR m Ab+抗人NKG2D m Ab及抗鼠Ig G m Ab封閉后的γδT細(xì)胞與im DCs以10:1直接共培養(yǎng)時(shí),TRAP染色陽(yáng)性的多核巨細(xì)胞數(shù)目(2.33±0.47個(gè)/10個(gè)視野)并未比相同比例的無(wú)抗體封閉培養(yǎng)組(3.33±1.53個(gè)/10個(gè)視野)數(shù)目增加,顯示抗體封閉并未對(duì)γδT細(xì)胞抑制OCs生成的過(guò)程產(chǎn)生影響(p0.05);(5)γδT細(xì)胞與im DCs共培養(yǎng)比例分別為1:1、5:1、10:1時(shí),培養(yǎng)24小時(shí)后直接共培養(yǎng)組上清中IFN-γ的濃度分別為617.09 pg/ml、900.1 pg/ml、1277.34 pg/ml,間接共培養(yǎng)組濃度分別為509.68pg/ml、786.49 pg/ml、1045.5 pg/ml。顯示隨著γδT細(xì)胞比例的增高,其分泌IFN-γ的能力亦隨之增高,且im DCs與γδT細(xì)胞直接共培養(yǎng)相對(duì)間接共培養(yǎng)來(lái)說(shuō),im DCs刺激γδT細(xì)胞分泌IFN-γ的能力更明顯;當(dāng)兩種細(xì)胞比例為1:1時(shí),γδT細(xì)胞與CD14+單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),CTX-I基本不分泌;與im DCs以1:1比例共培養(yǎng)時(shí),直接接觸共培養(yǎng)上清液中CTX-I的水平(397.01 pg/ml)低于間接接觸共培養(yǎng)組(459.47 pg/ml);γδT細(xì)胞與OCs作用24小時(shí)后,直接共培養(yǎng)組上清液中檢測(cè)不到CTX-I,間接組的水平(83.245 pg/ml)低于OCs單獨(dú)培養(yǎng)組(889.54 pg/ml),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:(1)體外培養(yǎng)條件下,γδT細(xì)胞具有殺傷MM細(xì)胞的作用,其機(jī)制可能與其表面TCR和NKG2D受體介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān);(2)γδT細(xì)胞可在OCs分化發(fā)育的各個(gè)階段抑制OCs的生成并溶解成熟OCs,其抑制作用的機(jī)制并不與細(xì)胞表面TCR和NKG2D受體介導(dǎo)的途徑有關(guān);(3)IFN-γ可能在γδT細(xì)胞抑制OCs生成的過(guò)程中發(fā)揮作用。因此,γδT細(xì)胞有希望成為MM細(xì)胞免疫治療的一種選擇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.3
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本文編號(hào)：
2417245
