【摘要】：研究背景與目的:肺癌是目前臨床上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,每年因肺癌死亡的患者約占所有腫瘤死亡患者的20%。根據(jù)病理類型和臨床表現(xiàn),肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類,其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌患者總數(shù)的80~85%。肺癌轉(zhuǎn)移能力很強,據(jù)統(tǒng)計,約65%的肺癌患者在初次就診時就已經(jīng)伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。骨骼系統(tǒng)是肺癌轉(zhuǎn)移最常見的受累部位之一,約半數(shù)的骨轉(zhuǎn)移灶發(fā)生在脊椎,其次是肋骨,約占所有骨轉(zhuǎn)移的27%,一般均為溶骨性破壞。這些患者不得不忍受因骨破壞所造成的劇烈疼痛和病理性骨折,脊柱轉(zhuǎn)移病灶還有可能造成患者出現(xiàn)脊髓壓迫甚至癱瘓等并發(fā)癥。目前針對肺癌骨轉(zhuǎn)移的治療手段通常是使用放療或雙磷酸鹽類藥物延緩骨破壞的進程,少部分經(jīng)臨床評估預(yù)后較好的患者可手術(shù)切除病灶。盡管目前臨床醫(yī)師對肺癌患者采取了系統(tǒng)性綜合治療的方法,肺癌骨轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后仍然極差,出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者中位生存期只有六個月,5年生存率不超過5%。因此,對伴有骨轉(zhuǎn)移的肺癌患者的治療是臨床工作中一個頗為棘手的問題。目前,人們對腫瘤在人體內(nèi)轉(zhuǎn)移的基本過程已經(jīng)有了較為清楚的認(rèn)識。腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中通常需要經(jīng)歷以下四個關(guān)鍵步驟:1、脫離腫瘤原發(fā)病灶2、侵犯相鄰正常組織或穿透基底膜3、經(jīng)由毛細(xì)血管或淋巴管進入血液循環(huán)4、保持細(xì)胞活性并離開血液循環(huán)進入靶器官5、自我增殖并與微環(huán)境相互作用,最終形成轉(zhuǎn)移灶。對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制的研究是目前國內(nèi)外研究熱點之一,但由于腫瘤轉(zhuǎn)移過程復(fù)雜,且每一步都涉及多條信號通路,進展較為緩慢。細(xì)胞由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變的過程稱為上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),由于發(fā)生EMT的細(xì)胞與周圍細(xì)胞間粘附性降低,運動能力增強,便于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶中脫離,EMT被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵的始動因素。雖然無限生長是腫瘤的標(biāo)志性特征之一,但人們發(fā)現(xiàn)并不是所有的腫瘤細(xì)胞都具有無限增殖的的能力。研究表明,在實體腫瘤中存在著少數(shù)具有高度增殖能力的腫瘤細(xì)胞。只需少量這類細(xì)胞便能在免疫缺陷動物中形成一個新的腫瘤,而要達(dá)到同樣效果則需要至少100倍數(shù)量級的原代腫瘤細(xì)胞。人們把這種具有類似正常干細(xì)胞的增殖潛能的腫瘤細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞。目前研究表明,EMT跟腫瘤干細(xì)胞間存在著緊密聯(lián)系,如果在上皮型腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)SNAI1和TWIST1等EMT管家基因,則腫瘤細(xì)胞在發(fā)生EMT的同時,也表現(xiàn)出了干細(xì)胞的某些特性。隨著抗體芯片技術(shù)的成熟,人們能從幾乎所有實體腫瘤患者的外周血中檢測到腫瘤細(xì)胞,這種存在于血液循環(huán)中腫瘤細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells CTCs)。CTCs的數(shù)量與臨床腫瘤患者的預(yù)后之間存在著一定聯(lián)系。但CTCs的數(shù)量與臨床轉(zhuǎn)移灶之間卻沒有明顯的相關(guān)聯(lián)系。進一步分析結(jié)果表明,CTCs細(xì)胞中存在著多種細(xì)胞亞型,其中間質(zhì)型的CTCs只占CTCs的一小部分。通過綜合考慮EMT、CTCs和腫瘤干細(xì)胞的定義與特點,我們推測,只有發(fā)生了上皮間質(zhì)化的CTCs才有可能形成新的轉(zhuǎn)移灶。因此,分離并檢測分析發(fā)生了EMT的CTCs可以使我們進一步的了解肺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和分子機制。并為針對腫瘤轉(zhuǎn)移的靶向藥物的研制提供潛在的研究方向和治療靶點。研究內(nèi)容與方法:首先,我們選取長征醫(yī)院胸外科進行手術(shù)的肺癌患者肺癌原發(fā)灶樣本和骨轉(zhuǎn)移灶樣本,并利用患者肺癌瘤旁正常肺組織作為對照,利用免疫組化的方法檢測樣本中常見上皮細(xì)胞標(biāo)記CDH1、EPCAM和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物VIM的表達(dá)水平。隨后我們通過使用前期研究中得到的具有一定親骨特性的人肺腺癌細(xì)胞系PC-9H對BCLB/c裸鼠進行肺原位注射荷瘤。通過流式細(xì)胞分選的方法從BCLB/c裸鼠外周血中分離發(fā)生了EMT的肺癌細(xì)胞PC-9EMT。并動態(tài)觀察腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。在得到PC-9EMT細(xì)胞后,我們通過MTS、蛋白免疫印跡試驗、細(xì)胞免疫熒光實驗、Transwell實驗、克隆形成實驗、成球細(xì)胞培養(yǎng)實驗、細(xì)胞周期和凋亡檢測實驗和鼠巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化等實驗比較PC-9EMT、PC-9H和原始PC-9細(xì)胞株之間的差異,觀察并驗證PC-9EMT細(xì)胞的生物學(xué)特性。最后我們通過對PC-9EMT、PC-9H和原始PC-9細(xì)胞進行了真核轉(zhuǎn)錄組測序并對測序結(jié)果中感興趣的關(guān)鍵基因進行了實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)驗證,最后再使用公共數(shù)據(jù)庫對差異基因進行了生物信息學(xué)分析,初步探究了肺癌骨轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)調(diào)控機制。研究結(jié)果與結(jié)論:通過上述實驗,我們在此次研究中得到了下列結(jié)果。1、建立了可重復(fù)檢測外周血中CTCs的肺原位移植瘤BCLB/c裸鼠模型。2、在BCLB/c裸鼠肺原位移植瘤外周血中分離出發(fā)生了EMT的肺癌細(xì)胞PC-9EMT并成功進行了體外培養(yǎng)。3、通過細(xì)胞學(xué)實驗證明PC-9EMT細(xì)胞同時具有間質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞的特征。4、通過對PC-9EMT細(xì)胞進行真核轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)FN1、SNAI1、TWIST1、COL1A1、COL6A1、JUP、OCLN、L1CAM、KRT17、S100A4、KPTN、MMP9、DLC1和EMP3基因可能在肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過上述研究,我們建立了一個簡便易行的人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植瘤模型,通過這個動物模型我們可以動態(tài)的觀察腫瘤細(xì)胞在BCLB/c裸鼠體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移情況,并且可以通過流式細(xì)胞技術(shù)從少量外周血中檢測和分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞。為研究肺癌轉(zhuǎn)移提供了新的研究手段和方法。隨后我們通過這個新的動物模型獲得了發(fā)生上皮間質(zhì)化的循環(huán)腫瘤細(xì)胞PC-9EMT,并且通過體外實驗證明PC-9EMT具有較高的增殖、遷移能力,且對肺癌常用的鉑類化療藥物具有耐受性。PC-9EMT細(xì)胞在體外共培養(yǎng)條件下還能誘導(dǎo)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。這些結(jié)果表明,發(fā)生EMT的CTCs具有腫瘤干細(xì)胞的特征,在肺癌的耐藥、復(fù)發(fā)和骨轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色。最后,我們通過進一步分析PC-9EMT細(xì)胞的基因表達(dá)情況,挑選出了可能的關(guān)鍵基因,為后續(xù)肺癌骨轉(zhuǎn)移分子機制的深入研究提供了初步的理論和實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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6 香港麥迪信醫(yī)學(xué)出版有限公司供稿;腫瘤干細(xì)胞將成治癌新靶點[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

7 記者 楊帆　實習(xí)生 楊周;“腫瘤干細(xì)胞研究”在渝實施[N];重慶日報;2009年

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本文編號：2416530