【摘要】：研究背景與目的:肺癌是目前臨床上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,每年因肺癌死亡的患者約占所有腫瘤死亡患者的20%。根據(jù)病理類型和臨床表現(xiàn),肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩大類,其中非小細胞肺癌約占肺癌患者總數(shù)的80~85%。肺癌轉移能力很強,據(jù)統(tǒng)計,約65%的肺癌患者在初次就診時就已經(jīng)伴有遠處轉移。骨骼系統(tǒng)是肺癌轉移最常見的受累部位之一,約半數(shù)的骨轉移灶發(fā)生在脊椎,其次是肋骨,約占所有骨轉移的27%,一般均為溶骨性破壞。這些患者不得不忍受因骨破壞所造成的劇烈疼痛和病理性骨折,脊柱轉移病灶還有可能造成患者出現(xiàn)脊髓壓迫甚至癱瘓等并發(fā)癥。目前針對肺癌骨轉移的治療手段通常是使用放療或雙磷酸鹽類藥物延緩骨破壞的進程,少部分經(jīng)臨床評估預后較好的患者可手術切除病灶。盡管目前臨床醫(yī)師對肺癌患者采取了系統(tǒng)性綜合治療的方法,肺癌骨轉移的患者預后仍然極差,出現(xiàn)骨轉移的非小細胞肺癌患者中位生存期只有六個月,5年生存率不超過5%。因此,對伴有骨轉移的肺癌患者的治療是臨床工作中一個頗為棘手的問題。目前,人們對腫瘤在人體內(nèi)轉移的基本過程已經(jīng)有了較為清楚的認識。腫瘤細胞在轉移過程中通常需要經(jīng)歷以下四個關鍵步驟:1、脫離腫瘤原發(fā)病灶2、侵犯相鄰正常組織或穿透基底膜3、經(jīng)由毛細血管或淋巴管進入血液循環(huán)4、保持細胞活性并離開血液循環(huán)進入靶器官5、自我增殖并與微環(huán)境相互作用,最終形成轉移灶。對腫瘤轉移相關分子機制的研究是目前國內(nèi)外研究熱點之一,但由于腫瘤轉移過程復雜,且每一步都涉及多條信號通路,進展較為緩慢。細胞由上皮細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞形態(tài)轉變的過程稱為上皮—間質(zhì)轉化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),由于發(fā)生EMT的細胞與周圍細胞間粘附性降低,運動能力增強,便于腫瘤細胞從原發(fā)灶中脫離,EMT被認為是腫瘤細胞轉移過程中關鍵的始動因素。雖然無限生長是腫瘤的標志性特征之一,但人們發(fā)現(xiàn)并不是所有的腫瘤細胞都具有無限增殖的的能力。研究表明,在實體腫瘤中存在著少數(shù)具有高度增殖能力的腫瘤細胞。只需少量這類細胞便能在免疫缺陷動物中形成一個新的腫瘤,而要達到同樣效果則需要至少100倍數(shù)量級的原代腫瘤細胞。人們把這種具有類似正常干細胞的增殖潛能的腫瘤細胞稱為腫瘤干細胞。目前研究表明,EMT跟腫瘤干細胞間存在著緊密聯(lián)系,如果在上皮型腫瘤細胞中過表達SNAI1和TWIST1等EMT管家基因,則腫瘤細胞在發(fā)生EMT的同時,也表現(xiàn)出了干細胞的某些特性。隨著抗體芯片技術的成熟,人們能從幾乎所有實體腫瘤患者的外周血中檢測到腫瘤細胞,這種存在于血液循環(huán)中腫瘤細胞被稱為循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells CTCs)。CTCs的數(shù)量與臨床腫瘤患者的預后之間存在著一定聯(lián)系。但CTCs的數(shù)量與臨床轉移灶之間卻沒有明顯的相關聯(lián)系。進一步分析結果表明,CTCs細胞中存在著多種細胞亞型,其中間質(zhì)型的CTCs只占CTCs的一小部分。通過綜合考慮EMT、CTCs和腫瘤干細胞的定義與特點,我們推測,只有發(fā)生了上皮間質(zhì)化的CTCs才有可能形成新的轉移灶。因此,分離并檢測分析發(fā)生了EMT的CTCs可以使我們進一步的了解肺癌骨轉移的細胞和分子機制。并為針對腫瘤轉移的靶向藥物的研制提供潛在的研究方向和治療靶點。研究內(nèi)容與方法:首先,我們選取長征醫(yī)院胸外科進行手術的肺癌患者肺癌原發(fā)灶樣本和骨轉移灶樣本,并利用患者肺癌瘤旁正常肺組織作為對照,利用免疫組化的方法檢測樣本中常見上皮細胞標記CDH1、EPCAM和間質(zhì)細胞標志物VIM的表達水平。隨后我們通過使用前期研究中得到的具有一定親骨特性的人肺腺癌細胞系PC-9H對BCLB/c裸鼠進行肺原位注射荷瘤。通過流式細胞分選的方法從BCLB/c裸鼠外周血中分離發(fā)生了EMT的肺癌細胞PC-9EMT。并動態(tài)觀察腫瘤的生長和轉移情況。在得到PC-9EMT細胞后,我們通過MTS、蛋白免疫印跡試驗、細胞免疫熒光實驗、Transwell實驗、克隆形成實驗、成球細胞培養(yǎng)實驗、細胞周期和凋亡檢測實驗和鼠巨噬細胞向破骨細胞誘導分化等實驗比較PC-9EMT、PC-9H和原始PC-9細胞株之間的差異,觀察并驗證PC-9EMT細胞的生物學特性。最后我們通過對PC-9EMT、PC-9H和原始PC-9細胞進行了真核轉錄組測序并對測序結果中感興趣的關鍵基因進行了實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)驗證,最后再使用公共數(shù)據(jù)庫對差異基因進行了生物信息學分析,初步探究了肺癌骨轉移的分子生物學調(diào)控機制。研究結果與結論:通過上述實驗,我們在此次研究中得到了下列結果。1、建立了可重復檢測外周血中CTCs的肺原位移植瘤BCLB/c裸鼠模型。2、在BCLB/c裸鼠肺原位移植瘤外周血中分離出發(fā)生了EMT的肺癌細胞PC-9EMT并成功進行了體外培養(yǎng)。3、通過細胞學實驗證明PC-9EMT細胞同時具有間質(zhì)細胞和干細胞的特征。4、通過對PC-9EMT細胞進行真核轉錄組測序,發(fā)現(xiàn)FN1、SNAI1、TWIST1、COL1A1、COL6A1、JUP、OCLN、L1CAM、KRT17、S100A4、KPTN、MMP9、DLC1和EMP3基因可能在肺癌骨轉移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過上述研究,我們建立了一個簡便易行的人肺腺癌BCLB/c裸鼠肺原位移植瘤模型,通過這個動物模型我們可以動態(tài)的觀察腫瘤細胞在BCLB/c裸鼠體內(nèi)的生長和轉移情況,并且可以通過流式細胞技術從少量外周血中檢測和分離循環(huán)腫瘤細胞。為研究肺癌轉移提供了新的研究手段和方法。隨后我們通過這個新的動物模型獲得了發(fā)生上皮間質(zhì)化的循環(huán)腫瘤細胞PC-9EMT,并且通過體外實驗證明PC-9EMT具有較高的增殖、遷移能力,且對肺癌常用的鉑類化療藥物具有耐受性。PC-9EMT細胞在體外共培養(yǎng)條件下還能誘導單核細胞向破骨細胞分化。這些結果表明,發(fā)生EMT的CTCs具有腫瘤干細胞的特征,在肺癌的耐藥、復發(fā)和骨轉移過程中扮演著重要的角色。最后,我們通過進一步分析PC-9EMT細胞的基因表達情況,挑選出了可能的關鍵基因,為后續(xù)肺癌骨轉移分子機制的深入研究提供了初步的理論和實驗依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 劉麗萍;腫瘤誘導細胞獲得分離[J];國外醫(yī)學.藥學分冊;2003年05期

2 NellBoyce ,陶然;腫瘤干細胞:惡性腫瘤的種子[J];世界科學;2003年12期

3 任樂榮,劉玉琴;腫瘤干細胞研究進展[J];四川腫瘤防治;2004年01期

4 劉坤;腫瘤干細胞的研究現(xiàn)狀[J];國外醫(yī)學.口腔醫(yī)學分冊;2004年02期

5 邵世宏,姚運紅;干細胞、腫瘤干細胞與腫瘤的關系[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2005年03期

6 劉雨瀟,楊繼建,張惠茹,竇忠英;干細胞與腫瘤研究進展[J];中國農(nóng)學通報;2005年06期

7 鐘明媚,陳飛虎;腫瘤干細胞的研究進展[J];安徽醫(yī)藥;2005年08期

8 鐘明媚,陳飛虎,樊嘉祿;腫瘤干細胞與腫瘤治療[J];醫(yī)學與哲學;2005年08期

9 孫建聰,曾波航;腫瘤干細胞研究進展[J];廣州醫(yī)學院學報;2005年03期

10 周思朗;張積仁;;腫瘤干細胞[J];腫瘤防治研究;2005年11期

相關會議論文 前10條

1 胡以平;;關于腫瘤干細胞問題的一些思考[A];中國環(huán)境誘變劑學會第14屆學術交流會議論文集[C];2009年

2 甄紅英;王淑玲;;力達霉素抑制腫瘤干細胞的作用機制研究[A];2009醫(yī)學前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學術會議論文集[C];2009年

3 金潤銘;;腫瘤干細胞及其生物學特點[A];基因開啟未來：新時代的遺傳學與科技進步——湖北省遺傳學會第八次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編[C];2009年

4 羅丁三;;基于中醫(yī)藥視角下的腫瘤干細胞研究進展[A];甘肅省中醫(yī)藥學會2013年學術年會論文集[C];2013年

5 陸士新;;腫瘤干細胞及其對腫瘤治療理念的影響[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會教育集暨論文集[C];2009年

6 湯永民;;腫瘤干細胞及其靶向治療[A];中國抗癌協(xié)會第七屆全國小兒腫瘤學術會議論文匯編[C];2007年

7 張宏權;;腫瘤干細胞與腫瘤的侵襲與轉移[A];第九屆全國腫瘤轉移學術大會暨2011年黑龍江省醫(yī)學會腫瘤學年會報告集[C];2011年

8 吳沛宏;高飛;顧仰葵;;現(xiàn)代腫瘤微創(chuàng)治療進展[A];中國(第七屆)腫瘤微創(chuàng)治療學術大會暨世界影像導引下腫瘤微創(chuàng)治療學會成立籌備大會論文匯編[C];2011年

9 周凱旋;艾軍;單保恩;;腫瘤干細胞研究:一個漫長且不尋常的旅程[A];第十四屆中國科協(xié)年會第17分會場：環(huán)境危害與健康防護研討會論文集[C];2012年

10 譚亞軍;侯啟明;張庶民;;腫瘤干細胞研究的問題和進展[A];2012年中國藥學大會暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

相關重要報紙文章 前10條

1 潘文;腫瘤干細胞為癌癥治療帶來新曙光[N];中國醫(yī)藥報;2006年

2 本版編輯邋海上飛魚 葛秋芳 王艷紅;揪出腫瘤的“元兇”——腫瘤干細胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

3 潘文;腫瘤干細胞：為根治癌癥帶來新曙光[N];中國醫(yī)藥報;2007年

4 記者 葉芳 通訊員 黃金娟;化療可刺激普通腫瘤細胞變腫瘤干細胞[N];廣東科技報;2009年

5 記者 藍建中;滅腫瘤干細胞有望根治癌癥[N];新華每日電訊;2013年

6 香港麥迪信醫(yī)學出版有限公司供稿;腫瘤干細胞將成治癌新靶點[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

7 記者 楊帆　實習生 楊周;“腫瘤干細胞研究”在渝實施[N];重慶日報;2009年

8 何雷;“973”計劃腫瘤干細胞項目啟動[N];健康報;2009年

9 記者 陳楓　通訊員 黃金娟 陳捚;廣東院士研究成果將影響癌癥治療策略[N];南方日報;2009年

10 高凡;化療或是癌癥復發(fā)根源[N];科學導報;2009年

相關博士學位論文 前10條

1 楊孟選;荷載腫瘤干細胞抗原的樹突細胞疫苗聯(lián)合糖脂類分子治療小鼠結腸癌的實驗研究[D];復旦大學;2014年

2 林鋮;人miR-489靶向p38α誘導腫瘤細胞自噬[D];浙江大學;2015年

3 孫翠翠;雙聯(lián)芐類化合物Riccardin D的抗腫瘤作用及機制研究[D];山東大學;2015年

4 孫蓉;納米載體同步輸送藥物用于腫瘤干細胞治療的研究[D];中國科學技術大學;2015年

5 趙志舉;miR-221對正常乳腺和乳腺腫瘤干細胞調(diào)控的研究[D];中國科學技術大學;2015年

6 蔡啟亮;CD44+腫瘤干/祖細胞在前列腺癌侵襲和轉移中的作用和機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2015年

7 劉紅;宮頸癌干細胞的分選及放療抵抗機制的研究[D];河北醫(yī)科大學;2016年

8 侯春英;MET-PI3K-Akt信號通路介導miRNA-31調(diào)控肺腺癌腫瘤干細胞功能[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2016年

9 李文新;靶向腫瘤干細胞“Akt-Oct4”調(diào)控通路的小分子藥物初步研究[D];浙江大學;2016年

10 葛春蕾;miR-942活化Wnt/β-catenin通路促進ESCC腫瘤干細胞干性的作用研究[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 邱暢;CD44聯(lián)合Prpc作為胃癌干細胞的初步研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2015年

2 何文婷;載索拉非尼及蘿卜硫素介孔二氧化硅脂質(zhì)納米粒聯(lián)用體外抗腫瘤細胞與腫瘤干細胞作用研究[D];福建中醫(yī)藥大學;2015年

3 毛驍麗;穿膜肽聯(lián)合鹽霉素磷脂膠束靶向腫瘤干細胞的實驗研究[D];福建中醫(yī)藥大學;2015年

4 王喜隆;~1H-MVS參數(shù)Cho/Cr與腫瘤干細胞標記物關系研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2015年

5 譚燦亮;人甲狀腺癌中腫瘤干細胞樣細胞的分離培養(yǎng)與鑒定[D];南方醫(yī)科大學;2015年

6 洪少馥;超聲輻照聯(lián)合紫杉醇對三維腫瘤球細胞毒性效果評價及其機制的研究[D];南方醫(yī)科大學;2015年

7 張成龍;利用CD133~+腫瘤表面標記物分離、鑒定和培養(yǎng)胃癌腫瘤干細胞的實驗研究[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

8 尹曉龍;卵巢癌腫瘤干細胞的研究進展[D];蚌埠醫(yī)學院;2015年

9 劉觀成;鼻咽癌中腫瘤干細胞標記物的表達研究[D];桂林醫(yī)學院;2015年

10 徐望;5-氟尿嘧啶對人舌鱗癌Tca8113中腫瘤干細胞富集作用[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

，

本文編號：2416530