【摘要】：背景彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常見的類型,在歐美國家?guī)缀跽妓蠳HL的1/3,在亞洲國家占NHL大于40%[1]。這類淋巴瘤占以前臨床上的“侵襲性”或“中高度惡性”淋巴瘤的大多數(shù)病例。DLBCL在形態(tài)學(xué)、免疫表型、遺傳學(xué)和臨床表現(xiàn)極具異質(zhì)性[2],其生長迅速,但是一般對治療反應(yīng)較好,5年生存率可達75-80%,經(jīng)過CHOP樣方案治療,3/4的患者在治療后沒有癥狀,近50%患者可以治愈,但是仍有30%-40%的DLBCL出現(xiàn)初始原發(fā)耐藥、疾病殘留或完全緩解后復(fù)發(fā),盡管高劑量解救性化療和造血干細胞移植可提高復(fù)發(fā)/難治患者的有效率,但絕大多數(shù)患者最終復(fù)發(fā)。近幾年,針對與腫瘤發(fā)生有關(guān)的細胞信號通路、原癌基因和抑癌基因、細胞因子及受體的分子靶向藥物治療已初顯成效[3-6]。因此,進一步研究本疾病的發(fā)病機理和新的治療方法尤為重要。近年來,隨著腫瘤免疫學(xué)研究的不斷深入,研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的各個階段,腫瘤與機體免疫系統(tǒng)存在著復(fù)雜多變的關(guān)系。許多腫瘤相關(guān)抗原被確認為自身免疫系統(tǒng)的成分[7],因此腫瘤免疫在某種程度上可以說是自身免疫,而自身免疫耐受可能阻礙腫瘤免疫過程[8]。在自身免疫耐受的諸多機制中,目前的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞在自身免疫耐受中扮演著重要的角色,它們的缺陷和功能失調(diào)將直接引起自身免疫性疾病[9]。T細胞的活化是由兩種活化信號共同參與的,第一信號首先由T細胞受體(TCR)識別抗原,然后經(jīng)CD3分子將刺激信號傳導(dǎo)至細胞內(nèi)[10]。第二信號是由抗原提成細胞或靶細胞表面的協(xié)同刺激分子與T細胞表面相應(yīng)的協(xié)同刺激分子相互作用而產(chǎn)生的。而協(xié)同刺激分子是受共刺激因子和共抑制因子調(diào)節(jié)的,調(diào)節(jié)著T細胞激活的強度和免疫應(yīng)答的幅度。但是,T細胞在慢性病毒感染或長時間接觸腫瘤抗原時就會異常表達共抑制因子,其效應(yīng)功能就會受到抑制而不能發(fā)揮正常作用。因此,研究這些協(xié)同刺激信號有助于探索新的免疫治療策略。PD-1和TIM-3是協(xié)調(diào)刺激分子家族重要成員,均屬于負性調(diào)控因子,不僅參與調(diào)節(jié)自身免疫過程,而且在腫瘤免疫中也起著重要作用。PD-1(程序性死亡受體-1,programmed death 1)為CD28超家族成員,主要表達于T淋巴細胞、B淋巴細胞、骨髓細胞上,可促進T淋巴細胞的活化并上調(diào)效應(yīng)期的淋巴細胞功能。有研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠PD-1基因可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生,提示PD-1很可能是一種重要的免疫抑制分子,在免疫耐受及腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮著重要的作用。因此,以PD-1為靶點研究對抗腫瘤、抗自身免疫性疾病等均有重要的意義[11,12]。TIM-3 (T lymphocyte immune globulin mucin-3)是T淋巴細胞免疫球蛋白粘蛋白(TIM)基因家族成員,高表達于輔助性T細胞1(Thl)和細胞毒性T細胞(CTL)上,并產(chǎn)生抑制性信號從而導(dǎo)致Thl和CTL細胞的凋亡[13,14]。TIM-3引起Thl細胞程序性死亡的原因是TIM-3能與其配體半乳糖凝集素-9(Galectin-9,Gal-9)特異性結(jié)合,提供負性共刺激信號所致。因此,TIM-3可下調(diào)Thl細胞免疫反應(yīng),被認為是一種負性免疫調(diào)控因子。研究顯示,TIM-3對除Thl和CTL細胞外的其他類型免疫細胞也具有調(diào)節(jié)作用,在一些自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,其免疫調(diào)節(jié)功能成為研究的熱點[15]。也有研究表明[16-18],PD-1或／和TIM-3在實體瘤組織T淋巴細胞高表達,通過抗體阻斷PD-1和／或TIM-3信號通路能夠使腫瘤特異性T細胞的抗腫瘤活性得到恢復(fù)；封閉PD-1或／和TIM-3基因可以抑制腫瘤細胞的增殖,促進腫瘤細胞的凋亡。因此,PD-1和TIM-3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及凋亡中可能也起著重要作用。因此,本研究首先檢測了DLBCL患者外周血CD3+T細胞上PD-1和TIM-3的表達水平,分析其表達與臨床指標(biāo)、化療療效的關(guān)系,對比化療前后PD-1和TIM-3的變化,希望該研究能夠為將來DLBCL發(fā)病機理研究、進一步判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。本研究還通過慢病毒介導(dǎo),分別靶向沉默人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株OCI-Ly19中的PD-1基因和TIM-3基因,初步探討沉默PD-1基因、TIM-3基因?qū)θ藦浡驜細胞淋巴瘤細胞株OCI-Ly19的增殖、克隆、周期及凋亡的生物學(xué)行為的影響,進而為DLBCL的治療提供新的靶點和思路。目的1.探討PD-1和TIM-3在DLBCL患者CD3+T細胞的表達水平。2.分析PD-1和TIM-3的表達與臨床指標(biāo)的關(guān)系。3.對比DLBCL患者化療前后PD-1和TIM-3的變化。4.分析PD-1和TIM-3的表達與化療療效的關(guān)系。5.研究沉默PD-1基因、TIM-3基因?qū)CI-Ly19細胞的增殖、細胞周期分布的影響。6.探討沉默PD-1基因、TIM-3基因?qū)CI-Ly19細胞的克隆形成及凋亡的影響。方法1.46例初診DLBCL患者和30例健康對照者作為本研究的對象。2.采用流式細胞儀檢測化療前后患者與對照者PD-1和TIM-3的表達率。3.分別構(gòu)建PD-1、TIM-3慢病毒載體,用293T包裝濃縮生成病毒液,感染OCI-Ly19細胞,即PD-1基因沉默組(Lv-PD-1)、TIM-3基因沉默組(Lv-TIM-3)作為實驗組,另分別設(shè)陰性對照組(Lv-Con)和空白對照組(Con)。罩4.應(yīng)用實時定量PCR和Western-blot檢測慢病毒感染后PD-1、TIM-3基因和蛋白的表達。5.采用CCK-8和流式細胞術(shù)分別檢測OCI-Ly19細胞增殖、細胞周期及凋亡情況。6.所有實驗重復(fù)至少3次,應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,P0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.在DLBCL患者CD3+T細胞中PD-1和TIM-3的表達率都較正常對照者明顯升高。2.PD-1和TIM-3在Ⅰ/Ⅱ期DLBCL患者中無明顯變化,但在Ⅲ/Ⅳ期患者中的表達顯著增加。3. DLBCL患者中有B癥狀者、IPI評分2分者、LDH及Ki-67水平高者PD-1和TIM-3的表達水平亦升高。4.PD-1和TIM-3的表達水平在化療前、標(biāo)準(zhǔn)化療2個療程后、4個療程后逐漸下降。5.低表達PD-1和TIM-3患者的治療有效率高于高表達者。6.PD-1基因沉默組OCI-Ly19細胞PD-1mRNA及PD-1蛋白含量明顯下降；TIM-3基因沉默組OCI-Ly19細胞TIM-3mRNA及TIM-3蛋白含量也明顯下降。7.與陰性對照組和空白對照組相比,沉默PD-1、TIM-3基因后OCI-Ly19細胞的增殖能力明顯下降,G0/G1期的細胞比例升高,S期細胞比例下降。8.沉默PD-1、TIM-3基因后OCI-Ly19細胞克隆形成能力與陰性對照組和空白對照組相比下降,凋亡率升高。結(jié)論1. DLBCL患者CD3+T細胞PD-1和TIM-3的水平升高,其表達與DLBCL的分期、預(yù)后及增殖均有關(guān),在DLBCL的發(fā)展中起重要作用。2.PD-1和TIM-3的表達水平隨化療進行逐漸下調(diào),且與化療有效率有關(guān),可作為DLBCL患者化療敏感指標(biāo)及預(yù)后因素。3.沉默PD-1基因、TIM-3基因可有效抑制OCI-Ly19細胞的增殖,使OCI-Ly19細胞克隆能力下降。4.沉默PD-1基因、TIM-3基因可促進OCI-Ly19細胞的凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Expression of recombination-activating genes and T cell receptor gene recombination in the human T cell leukemia cell line[J];Chinese Medical Journal;2007年05期

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本文編號：2414805