【摘要】：在全世界范圍內(nèi),食管癌一直是最具致命性的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在逐年增長(zhǎng),每年約有22萬(wàn)人死于食管癌。然而,由于食管癌的易向局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的高侵襲性以及對(duì)化療的不敏感性,食管癌的治療仍是一個(gè)棘手的問(wèn)題。因此,致力于有效的化合物或藥物的研究就顯得非常必要和迫切,同時(shí)探討其作用機(jī)制也為開(kāi)發(fā)新的藥物提供重要的治療策略。ROS(Reactive oxygen species,活性氧族)的產(chǎn)生是非手術(shù)方法(例如:化療和放療)治療腫瘤的共同特征,因?yàn)镽OS能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡。目前,誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生已成為治療腫瘤的一個(gè)新手段。ROS,特別是H2O2(過(guò)氧化氫),在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可以作為第二信使發(fā)揮作用。H2O2通過(guò)改變靶蛋白(包括蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶,蛋白質(zhì)酪氨酸激酶,轉(zhuǎn)錄因子和受體酪氨酸激酶)的氧化壓力來(lái)調(diào)節(jié)蛋白的活性。這類藥物治療腫瘤的優(yōu)勢(shì)在于他殺傷細(xì)胞的高度選擇性。一般情況下,腫瘤細(xì)胞具有較高的氧化壓力,因此也具有相對(duì)較高的ROS水平,在這種環(huán)境下,如果腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平被誘導(dǎo)繼續(xù)升高,就會(huì)超過(guò)細(xì)胞耐受的閾值而導(dǎo)致細(xì)胞死亡,有趣的是,正常細(xì)胞則受影響較小,因?yàn)檎＜?xì)胞的ROS水平相對(duì)較低,而且具有強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)。因此,研發(fā)有效的產(chǎn)生ROS類藥物將為腫瘤治療提供新的方法,探討其作用機(jī)制也為此類藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。在本研究中,我們自主研發(fā)合成了化合HOI-02,并發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,并且抑制食管癌細(xì)胞的增殖和錨定非依賴性生長(zhǎng),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),HOI-02誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯并最終抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)顯示,HOI-02處理食管癌細(xì)胞24h可以導(dǎo)致近60%的細(xì)胞凋亡以及G2-M期阻滯,與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯相關(guān)的通路JNK/AP-1,Bcl2/caspase 3和ATM/p53-p21被激活。同時(shí),在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人源性腫瘤組織異體移植模型中,HOI-02也能夠明顯的抑制腫瘤組織質(zhì)量和體積的增長(zhǎng)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,HOI-02具有較好的抑制食管癌細(xì)胞和組織生長(zhǎng)的能力。同時(shí),HOI-02作為NO2基團(tuán)的化合物,和被替換為NH2基團(tuán)的化合物HOI-11相比較之后,我們發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠產(chǎn)生ROS并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯并最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),而HOI-11則不能對(duì)食管癌細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)。由此我們判斷NO2基團(tuán)是產(chǎn)生O2-的來(lái)源,這將為研發(fā)能夠產(chǎn)生ROS的藥物提供線索和依據(jù)。第一章HOI-02能夠抑制食管癌細(xì)胞的活性和錨定非依賴性生長(zhǎng)方法1.設(shè)計(jì)并合成化合物HOI-02和HOI-11;2.利用MS/MS方法檢測(cè)化合物HOI-02和HOI-11的純度;3.MTS法檢測(cè)HOI-02和HOI-11對(duì)食管癌細(xì)胞活性的影響;4.利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOI-02和HOI-11對(duì)食管癌細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)的影響。結(jié)果1.設(shè)計(jì)并合成了高純度的化合物HOI-02和HOI-112.HOI-02能夠劑量依賴性的抑制食管癌細(xì)胞的活性,而HOI-11對(duì)食管癌細(xì)胞影響不大MTS結(jié)果顯示,HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE510后能夠抑制細(xì)胞活力,且呈濃度和時(shí)間梯度依賴。10μM和20μM HOI-02處理KYSE510細(xì)胞48h,吸光度光譜490nm吸光值由0.5534分別降為0.25(P0.01)和0.093(P0.01),呈濃度梯度依賴。而HOI-11處理的食管癌細(xì)胞系KYSE30和KYSE510的細(xì)胞活性狀況則受影響較小。10μM和20μM HOI-11處理KYSE510細(xì)胞48h,吸光度光譜490nm吸光值由0.4114分別降為0.3972(P0.05)和0.394(P0.05)。3.HOI-02能夠抑制食管癌細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng),而HOI-11對(duì)食管癌細(xì)胞影響不大軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HOI-02能夠明顯的抑制食管癌細(xì)胞KYSE30,KYSE450和KYSE510的錨定非依賴性生長(zhǎng)。1μM HOI-02對(duì)KYSE510即有明顯的抑制作用(P0.05),5μM HOI-02能夠抑制70%的KYSE510細(xì)胞的生長(zhǎng)(P0.01),呈濃度梯度依賴。而食管癌細(xì)胞KYSE30和KYSE510的錨定非依賴性生長(zhǎng)情況則受HOI-11影響較小。10μM HOI-11對(duì)食管癌細(xì)胞克隆形成沒(méi)有明顯影響,僅僅20μM HOI-11時(shí)對(duì)細(xì)胞克隆形成有部分抑制作用。第二章HOI-02能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯方法1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)HOI-02對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響;2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)HOI-11對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響;3.TUNEL法分析HOI-02對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡的影響。結(jié)果1.HOI-02能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,相比對(duì)照組,20μM HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE51024h能夠誘導(dǎo)48.24%的細(xì)胞凋亡(早期和晚期凋亡分別是20.89%和27.15%,P0.01)和40.43%的G2-M期阻滯(P0.01),并呈濃度梯度依賴。2.HOI-11處理對(duì)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響較小流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,HOI-11處理食管癌細(xì)胞對(duì)凋亡和細(xì)胞周期阻滯影響不大。相比對(duì)照組,20μM HOI-11處理細(xì)胞KYSE510 24h僅能夠誘導(dǎo)4.63%的細(xì)胞凋亡和2.11%的G2-M期阻滯。3.TUNEL法表明HOI-02能夠明顯誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞KYSE510凋亡TUNEL分析結(jié)果顯示,TUNEL綠色熒光強(qiáng)度與HOI-02濃度呈劑量相關(guān)性。相比對(duì)照組,5μM HOI-02能夠誘導(dǎo)部分細(xì)胞凋亡,TUNEL綠色熒光強(qiáng)度增加,20μM HOI-02能夠明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,TUNEL綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。第三章HOI-02能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生方法1.通過(guò)DCFH-DA染色,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HOI-02和HOI-11處理食管癌細(xì)胞KYSE510時(shí)ROS的生成情況;2.在HOI-02/NADPH/FMN體系中,利用自旋捕獲劑DMPO監(jiān)測(cè)ROS信號(hào)的生成;3.MTS法檢測(cè)HOI-02與不同抗氧化劑NAC,GSH,Catalase和SOD共處理時(shí)對(duì)細(xì)胞活性的影響;4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)HOI-02與抗氧化劑NAC和GSH共處理時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯的影響。結(jié)果1.HOI-02能夠明顯的誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,而HOI-11不能夠明顯誘導(dǎo)ROS的生成流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,20μM HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE510 1h,3h,6h,12h和24h,其中處理1h既有ROS的生成(44.72%),6h時(shí)達(dá)到峰值(88.05%),24h時(shí)降低為32.18%。相比較HOI-02,HOI-11對(duì)細(xì)胞影響較小。2.在HOI-02/NADPH/FMN體系中,能夠檢測(cè)到較強(qiáng)的自由基信號(hào),而在HOI-11/NADPH/FMN體系中則不能EPR結(jié)果顯示,在電子捕獲劑DMPO的作用下,HOI-02/NADPH/FMN體系能夠產(chǎn)生明顯的自由基信號(hào),去除HOI-02后不能夠產(chǎn)生自由基信號(hào)。同時(shí)如果在此體系中增加上GSH或者Catalase,就發(fā)現(xiàn)自由基信號(hào)消失或減弱。而如果在體系中增加SOD,自由基信號(hào)基本不受影響,同時(shí)HOI-11/NADPH/FMN體系也不能夠產(chǎn)生信號(hào),說(shuō)明相比較HOI-02,HOI-11在此反應(yīng)體系中不能夠產(chǎn)生ROS。3.抗氧化劑NAC和GSH能夠抵消HOI-02對(duì)細(xì)胞的增長(zhǎng)抑制作用MTS結(jié)果顯示,用20μM HOI-02與抗氧化劑2.5m M NAC或者2.5m M GSH共處理食管癌細(xì)胞KYSE510時(shí),能夠抵消HOI-02對(duì)細(xì)胞增殖的抑制,細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與對(duì)照組相似。Catalase能夠部分抵消HOI-02對(duì)細(xì)胞增殖的抑制,而SOD與HOI-02共處理細(xì)胞時(shí),細(xì)胞的增殖狀況基本不受影響。4.抗氧化劑NAC和GSH能夠抵消HOI-02對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的影響流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,20μM HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE510 24h能夠引起明顯的細(xì)胞凋亡和G2-M期阻滯,而20μM HOI-02與2.5m M NAC或者2.5m M GSH共處理細(xì)胞時(shí),細(xì)胞不發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯。第四章HOI-02通過(guò)調(diào)節(jié)AP-1活性和caspase蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方法1.Western blotting檢測(cè)HOI-02不同時(shí)間以及不同濃度處理食管癌細(xì)胞KYSE510時(shí)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響;2.Western blotting檢測(cè)500μM H2O2處理細(xì)胞后對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響;3.熒光素酶報(bào)告基因的法檢測(cè)AP-1活性的變化。結(jié)果1.HOI-02處理細(xì)胞使凋亡相關(guān)蛋白被激活Western blotting結(jié)果顯示,20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后,p-cjun,p-c-fos,p-JNK,p-P38,c-PARP,c-caspase3和Bax表達(dá)增加,同時(shí)下調(diào)Bcl2的表達(dá)。不同濃度的HOI-02處理細(xì)胞后p-c-jun和p-c-fos的表達(dá)呈濃度梯度依賴,且HOI-02與NAC或者GSH共處理細(xì)胞后p-c-jun和p-c-fos的表達(dá)消失。2.500μM H2O2處理細(xì)胞后相關(guān)凋亡相關(guān)蛋白被激活Western blotting結(jié)果顯示,500μM H2O2處理食管癌KYSE510細(xì)胞后,p-cjun,p-c-fos,p-JNK和p-P38表達(dá)增加,我們發(fā)現(xiàn)與H2O2相比,HOI-02處理細(xì)胞能夠激活同樣的凋亡相關(guān)蛋白通路。3.隨著HOI-02處理細(xì)胞濃度增加,轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性隨之增加,同時(shí)抗氧化劑能夠抵消AP-1活性的增加熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,相比對(duì)照組,20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄因子AP-1升高2倍多,并呈濃度梯度依賴。同時(shí),20μM HOI-02與2.5m M NAC或者2.5m M GSH共處理時(shí),細(xì)胞內(nèi)AP-1活性恢復(fù)正常。第五章HOI-02通過(guò)調(diào)節(jié)P21相關(guān)的通路誘導(dǎo)細(xì)胞G2-M期阻滯方法1.Western blotting檢測(cè)20μM HOI-02不同時(shí)間以及不同濃度HOI-02處理食管癌細(xì)胞KYSE510對(duì)G2-M期阻滯相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響;2.分析HOI-02處理食管癌KYSE510后各種相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,建立HOI-02作用機(jī)制模型。結(jié)果1.HOI-02處理細(xì)胞使細(xì)胞周期G2-M期相關(guān)蛋白被激活Western blotting結(jié)果顯示,20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后,p-CDC2,p-ATR,p-ATM,p-H2AX,p-P53和P21升高,p-Cyclin B1(S147)降低,不同濃度的HOI-02處理細(xì)胞后p-CDC2,p-H2AX和P21的表達(dá)呈濃度梯度依賴,且HOI-02與NAC或者GSH共處理細(xì)胞后p-CDC2,p-H2AX和P21的表達(dá)消失。2.HOI-02作用機(jī)制分析HOI-02處理食管癌KYSE510細(xì)胞后,分析相關(guān)蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡要是通過(guò)JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3途徑發(fā)生,而ATM/P53-P21通路蛋白的變化則引起了G2-M期阻滯。第六章在人源性腫瘤組織異種移植模型中,HOI-02能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)方法1.通過(guò)人源性腫瘤組織異體移植模型(PDX)驗(yàn)證HOI-02對(duì)食管癌組織的生長(zhǎng)抑制作用;2.免疫組化和免疫熒光法檢測(cè)PDX模型中腫瘤組織的相關(guān)蛋白表達(dá)情況結(jié)果1.在PDX模型中,HOI-02能夠明顯抑制食管癌組織質(zhì)量和體積的增長(zhǎng)通過(guò)觀察PDX模型中腫瘤組織的變化,我們發(fā)現(xiàn)HOI-02治療食管癌組織周后,與對(duì)照組相比,HOI-02處理腫瘤組織6周后,低劑量組(10mg/kg)即能夠明顯降低腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積(p0.01),HOI-02高劑量組(50mg/kg)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制更為顯著。2.相關(guān)蛋白的免疫組化和免疫熒光分析免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,HOI-02治療后的腫瘤組織中Ki-67,p-c-jun,P21和c-caspase 3的表達(dá)均增加,且呈劑量依賴性。同時(shí),免疫熒光結(jié)果表明腫瘤組織中DCFH-DA的熒光強(qiáng)度隨著HOI-02濃度的增加隨之增強(qiáng)。結(jié)論1.HOI-02作為一新型的自主合成的化合物能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生,并由此通過(guò)JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3通路引發(fā)細(xì)胞凋亡,通過(guò)ATM/P53-P21通路引發(fā)G2-M期阻滯,同時(shí)HOI-02也能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞活性和錨定非依賴性生長(zhǎng)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)人源性組織異體移植模型中,我們也發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠明顯的抑制食管癌組織質(zhì)量和體積的增長(zhǎng),這為藥物的臨床篩選奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時(shí)也對(duì)誘導(dǎo)ROS的藥物作用機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。2.HOI-02(含有一硝基基團(tuán)-NO2)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS和腫瘤組織的生長(zhǎng)抑制作用,而HOI-11(含有一氨基基團(tuán)-NH2)則對(duì)食管癌細(xì)胞和組織生長(zhǎng)影響不大,由此推斷硝基基團(tuán)-NO2是誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS的主要原因,這為含有硝基基團(tuán)-NO2類化合物的研發(fā)提供線索和依據(jù),也為設(shè)計(jì)和合成更多的誘導(dǎo)ROS類藥物提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2412508