【摘要】：在全世界范圍內,食管癌一直是最具致命性的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在逐年增長,每年約有22萬人死于食管癌。然而,由于食管癌的易向局部和遠處轉移的高侵襲性以及對化療的不敏感性,食管癌的治療仍是一個棘手的問題。因此,致力于有效的化合物或藥物的研究就顯得非常必要和迫切,同時探討其作用機制也為開發(fā)新的藥物提供重要的治療策略。ROS(Reactive oxygen species,活性氧族)的產(chǎn)生是非手術方法(例如:化療和放療)治療腫瘤的共同特征,因為ROS能夠誘導腫瘤細胞的死亡。目前,誘導ROS的產(chǎn)生已成為治療腫瘤的一個新手段。ROS,特別是H2O2(過氧化氫),在細胞信號轉導過程中可以作為第二信使發(fā)揮作用。H2O2通過改變靶蛋白(包括蛋白質酪氨酸磷酸酶,蛋白質酪氨酸激酶,轉錄因子和受體酪氨酸激酶)的氧化壓力來調節(jié)蛋白的活性。這類藥物治療腫瘤的優(yōu)勢在于他殺傷細胞的高度選擇性。一般情況下,腫瘤細胞具有較高的氧化壓力,因此也具有相對較高的ROS水平,在這種環(huán)境下,如果腫瘤細胞內的ROS水平被誘導繼續(xù)升高,就會超過細胞耐受的閾值而導致細胞死亡,有趣的是,正常細胞則受影響較小,因為正常細胞的ROS水平相對較低,而且具有強大的抗氧化系統(tǒng)。因此,研發(fā)有效的產(chǎn)生ROS類藥物將為腫瘤治療提供新的方法,探討其作用機制也為此類藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。在本研究中,我們自主研發(fā)合成了化合HOI-02,并發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠誘導食管癌細胞ROS的產(chǎn)生,并且抑制食管癌細胞的增殖和錨定非依賴性生長,進一步研究發(fā)現(xiàn),HOI-02誘導產(chǎn)生ROS繼而導致細胞凋亡和G2-M期阻滯并最終抑制腫瘤細胞生長。數(shù)據(jù)顯示,HOI-02處理食管癌細胞24h可以導致近60%的細胞凋亡以及G2-M期阻滯,與細胞凋亡和細胞周期阻滯相關的通路JNK/AP-1,Bcl2/caspase 3和ATM/p53-p21被激活。同時,在體內實驗人源性腫瘤組織異體移植模型中,HOI-02也能夠明顯的抑制腫瘤組織質量和體積的增長。體內外實驗表明,HOI-02具有較好的抑制食管癌細胞和組織生長的能力。同時,HOI-02作為NO2基團的化合物,和被替換為NH2基團的化合物HOI-11相比較之后,我們發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠產(chǎn)生ROS并導致細胞凋亡和G2-M期阻滯并最終抑制腫瘤細胞的生長,而HOI-11則不能對食管癌細胞產(chǎn)生效應。由此我們判斷NO2基團是產(chǎn)生O2-的來源,這將為研發(fā)能夠產(chǎn)生ROS的藥物提供線索和依據(jù)。第一章HOI-02能夠抑制食管癌細胞的活性和錨定非依賴性生長方法1.設計并合成化合物HOI-02和HOI-11;2.利用MS/MS方法檢測化合物HOI-02和HOI-11的純度;3.MTS法檢測HOI-02和HOI-11對食管癌細胞活性的影響;4.利用軟瓊脂克隆形成實驗檢測HOI-02和HOI-11對食管癌細胞錨定非依賴性生長的影響。結果1.設計并合成了高純度的化合物HOI-02和HOI-112.HOI-02能夠劑量依賴性的抑制食管癌細胞的活性,而HOI-11對食管癌細胞影響不大MTS結果顯示,HOI-02處理食管癌細胞KYSE30和KYSE510后能夠抑制細胞活力,且呈濃度和時間梯度依賴。10μM和20μM HOI-02處理KYSE510細胞48h,吸光度光譜490nm吸光值由0.5534分別降為0.25(P0.01)和0.093(P0.01),呈濃度梯度依賴。而HOI-11處理的食管癌細胞系KYSE30和KYSE510的細胞活性狀況則受影響較小。10μM和20μM HOI-11處理KYSE510細胞48h,吸光度光譜490nm吸光值由0.4114分別降為0.3972(P0.05)和0.394(P0.05)。3.HOI-02能夠抑制食管癌細胞的錨定非依賴性生長,而HOI-11對食管癌細胞影響不大軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示,HOI-02能夠明顯的抑制食管癌細胞KYSE30,KYSE450和KYSE510的錨定非依賴性生長。1μM HOI-02對KYSE510即有明顯的抑制作用(P0.05),5μM HOI-02能夠抑制70%的KYSE510細胞的生長(P0.01),呈濃度梯度依賴。而食管癌細胞KYSE30和KYSE510的錨定非依賴性生長情況則受HOI-11影響較小。10μM HOI-11對食管癌細胞克隆形成沒有明顯影響,僅僅20μM HOI-11時對細胞克隆形成有部分抑制作用。第二章HOI-02能夠誘導食管癌細胞凋亡和G2-M期阻滯方法1.流式細胞儀檢測HOI-02對食管癌細胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響;2.流式細胞儀檢測HOI-11對食管癌細胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響;3.TUNEL法分析HOI-02對食管癌細胞KYSE510凋亡的影響。結果1.HOI-02能夠誘導食管癌細胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯流式細胞儀結果顯示,相比對照組,20μM HOI-02處理食管癌細胞KYSE51024h能夠誘導48.24%的細胞凋亡(早期和晚期凋亡分別是20.89%和27.15%,P0.01)和40.43%的G2-M期阻滯(P0.01),并呈濃度梯度依賴。2.HOI-11處理對食管癌細胞KYSE510凋亡和G2-M期阻滯的影響較小流式細胞儀結果顯示,HOI-11處理食管癌細胞對凋亡和細胞周期阻滯影響不大。相比對照組,20μM HOI-11處理細胞KYSE510 24h僅能夠誘導4.63%的細胞凋亡和2.11%的G2-M期阻滯。3.TUNEL法表明HOI-02能夠明顯誘導食管癌細胞KYSE510凋亡TUNEL分析結果顯示,TUNEL綠色熒光強度與HOI-02濃度呈劑量相關性。相比對照組,5μM HOI-02能夠誘導部分細胞凋亡,TUNEL綠色熒光強度增加,20μM HOI-02能夠明顯的誘導細胞凋亡,TUNEL綠色熒光強度明顯增強。第三章HOI-02能夠誘導ROS的產(chǎn)生方法1.通過DCFH-DA染色,用流式細胞儀檢測HOI-02和HOI-11處理食管癌細胞KYSE510時ROS的生成情況;2.在HOI-02/NADPH/FMN體系中,利用自旋捕獲劑DMPO監(jiān)測ROS信號的生成;3.MTS法檢測HOI-02與不同抗氧化劑NAC,GSH,Catalase和SOD共處理時對細胞活性的影響;4.流式細胞儀檢測HOI-02與抗氧化劑NAC和GSH共處理時對細胞凋亡和G2-M期阻滯的影響。結果1.HOI-02能夠明顯的誘導ROS產(chǎn)生,而HOI-11不能夠明顯誘導ROS的生成流式細胞儀結果顯示,20μM HOI-02處理食管癌細胞KYSE510 1h,3h,6h,12h和24h,其中處理1h既有ROS的生成(44.72%),6h時達到峰值(88.05%),24h時降低為32.18%。相比較HOI-02,HOI-11對細胞影響較小。2.在HOI-02/NADPH/FMN體系中,能夠檢測到較強的自由基信號,而在HOI-11/NADPH/FMN體系中則不能EPR結果顯示,在電子捕獲劑DMPO的作用下,HOI-02/NADPH/FMN體系能夠產(chǎn)生明顯的自由基信號,去除HOI-02后不能夠產(chǎn)生自由基信號。同時如果在此體系中增加上GSH或者Catalase,就發(fā)現(xiàn)自由基信號消失或減弱。而如果在體系中增加SOD,自由基信號基本不受影響,同時HOI-11/NADPH/FMN體系也不能夠產(chǎn)生信號,說明相比較HOI-02,HOI-11在此反應體系中不能夠產(chǎn)生ROS。3.抗氧化劑NAC和GSH能夠抵消HOI-02對細胞的增長抑制作用MTS結果顯示,用20μM HOI-02與抗氧化劑2.5m M NAC或者2.5m M GSH共處理食管癌細胞KYSE510時,能夠抵消HOI-02對細胞增殖的抑制,細胞的生長狀況與對照組相似。Catalase能夠部分抵消HOI-02對細胞增殖的抑制,而SOD與HOI-02共處理細胞時,細胞的增殖狀況基本不受影響。4.抗氧化劑NAC和GSH能夠抵消HOI-02對細胞凋亡和細胞周期阻滯的影響流式細胞儀結果顯示,20μM HOI-02處理食管癌細胞KYSE510 24h能夠引起明顯的細胞凋亡和G2-M期阻滯,而20μM HOI-02與2.5m M NAC或者2.5m M GSH共處理細胞時,細胞不發(fā)生凋亡和細胞周期阻滯。第四章HOI-02通過調節(jié)AP-1活性和caspase蛋白的表達誘導細胞凋亡方法1.Western blotting檢測HOI-02不同時間以及不同濃度處理食管癌細胞KYSE510時對凋亡相關蛋白表達水平的影響;2.Western blotting檢測500μM H2O2處理細胞后對凋亡相關蛋白表達水平的影響;3.熒光素酶報告基因的法檢測AP-1活性的變化。結果1.HOI-02處理細胞使凋亡相關蛋白被激活Western blotting結果顯示,20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細胞后,p-cjun,p-c-fos,p-JNK,p-P38,c-PARP,c-caspase3和Bax表達增加,同時下調Bcl2的表達。不同濃度的HOI-02處理細胞后p-c-jun和p-c-fos的表達呈濃度梯度依賴,且HOI-02與NAC或者GSH共處理細胞后p-c-jun和p-c-fos的表達消失。2.500μM H2O2處理細胞后相關凋亡相關蛋白被激活Western blotting結果顯示,500μM H2O2處理食管癌KYSE510細胞后,p-cjun,p-c-fos,p-JNK和p-P38表達增加,我們發(fā)現(xiàn)與H2O2相比,HOI-02處理細胞能夠激活同樣的凋亡相關蛋白通路。3.隨著HOI-02處理細胞濃度增加,轉錄因子AP-1的活性隨之增加,同時抗氧化劑能夠抵消AP-1活性的增加熒光素酶報告基因檢測顯示,相比對照組,20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細胞后轉錄因子AP-1升高2倍多,并呈濃度梯度依賴。同時,20μM HOI-02與2.5m M NAC或者2.5m M GSH共處理時,細胞內AP-1活性恢復正常。第五章HOI-02通過調節(jié)P21相關的通路誘導細胞G2-M期阻滯方法1.Western blotting檢測20μM HOI-02不同時間以及不同濃度HOI-02處理食管癌細胞KYSE510對G2-M期阻滯相關蛋白表達水平的影響;2.分析HOI-02處理食管癌KYSE510后各種相關蛋白的表達情況,建立HOI-02作用機制模型。結果1.HOI-02處理細胞使細胞周期G2-M期相關蛋白被激活Western blotting結果顯示,20μM HOI-02處理食管癌KYSE510細胞后,p-CDC2,p-ATR,p-ATM,p-H2AX,p-P53和P21升高,p-Cyclin B1(S147)降低,不同濃度的HOI-02處理細胞后p-CDC2,p-H2AX和P21的表達呈濃度梯度依賴,且HOI-02與NAC或者GSH共處理細胞后p-CDC2,p-H2AX和P21的表達消失。2.HOI-02作用機制分析HOI-02處理食管癌KYSE510細胞后,分析相關蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)細胞凋亡要是通過JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3途徑發(fā)生,而ATM/P53-P21通路蛋白的變化則引起了G2-M期阻滯。第六章在人源性腫瘤組織異種移植模型中,HOI-02能夠抑制腫瘤生長方法1.通過人源性腫瘤組織異體移植模型(PDX)驗證HOI-02對食管癌組織的生長抑制作用;2.免疫組化和免疫熒光法檢測PDX模型中腫瘤組織的相關蛋白表達情況結果1.在PDX模型中,HOI-02能夠明顯抑制食管癌組織質量和體積的增長通過觀察PDX模型中腫瘤組織的變化,我們發(fā)現(xiàn)HOI-02治療食管癌組織周后,與對照組相比,HOI-02處理腫瘤組織6周后,低劑量組(10mg/kg)即能夠明顯降低腫瘤質量和腫瘤體積(p0.01),HOI-02高劑量組(50mg/kg)對腫瘤生長抑制更為顯著。2.相關蛋白的免疫組化和免疫熒光分析免疫組化結果顯示,與對照組相比,HOI-02治療后的腫瘤組織中Ki-67,p-c-jun,P21和c-caspase 3的表達均增加,且呈劑量依賴性。同時,免疫熒光結果表明腫瘤組織中DCFH-DA的熒光強度隨著HOI-02濃度的增加隨之增強。結論1.HOI-02作為一新型的自主合成的化合物能夠誘導ROS的產(chǎn)生,并由此通過JNK/c-jun,c-fos/AP-1和BCL2/caspase3通路引發(fā)細胞凋亡,通過ATM/P53-P21通路引發(fā)G2-M期阻滯,同時HOI-02也能夠明顯抑制食管癌細胞活性和錨定非依賴性生長。在體內實驗人源性組織異體移植模型中,我們也發(fā)現(xiàn)HOI-02能夠明顯的抑制食管癌組織質量和體積的增長,這為藥物的臨床篩選奠定了實驗基礎,同時也對誘導ROS的藥物作用機制有了更深入的認識。2.HOI-02(含有一硝基基團-NO2)能夠誘導產(chǎn)生ROS和腫瘤組織的生長抑制作用,而HOI-11(含有一氨基基團-NH2)則對食管癌細胞和組織生長影響不大,由此推斷硝基基團-NO2是誘導產(chǎn)生ROS的主要原因,這為含有硝基基團-NO2類化合物的研發(fā)提供線索和依據(jù),也為設計和合成更多的誘導ROS類藥物提供理論基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 沈忠英,沈健,陳銘華,蔡維佳,陳彩云;氧化砷誘導食管癌細胞系細胞凋亡的研究(英文)[J];汕頭大學醫(yī)學院學報;2001年01期

2 王柏春,閻承慧,李野,王巨,禹亮,王勝發(fā),傅松濱;轉化生長因子β1抑制食管癌細胞的生長[J];基礎醫(yī)學與臨床;2004年05期

3 謝仰民;謝劍君;周飛;侯健;曹君君;許麗艷;李恩民;;激活轉錄因子3的過表達對食管癌細胞生長的抑制作用[J];癌變.畸變.突變;2009年04期

4 任建華;李瑞明;李超;熊奎;駱志國;;放射抗拒食管癌細胞系的建立及抗拒機制研究[J];中國腫瘤;2009年11期

5 張廣健;高蕊;張明鑫;金鑫;梁鵬;王健生;;放療分割劑量對食管癌細胞耐藥基因表達的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2010年02期

6 ;吃咖喱有助殺死食管癌細胞[J];中華中醫(yī)藥學刊;2011年05期

7 鐘z�，朱恩鳞E饃唬」癉�，，李国菤e撕錐

本文編號：2412508