發(fā)布時(shí)間：2019-01-20 14:27

【摘要】：第一部分IL-18在胰腺癌組織及胰腺癌患者血漿中表達(dá)的檢測(cè) 目的：篩選胰腺癌潛在的免疫治療因子,并擴(kuò)大樣本量在胰腺癌組織和胰腺癌患者血漿中進(jìn)行檢測(cè)。 方法：采用RayBiotech Human Cytokine Array分析3例胰腺癌及健康對(duì)照血漿中差異表達(dá)的細(xì)胞因子,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)組胰腺癌表達(dá)譜基因芯片數(shù)據(jù),初步確定研究對(duì)象；E-LISA檢測(cè)104例胰腺癌患者、35例胰腺良性腫瘤患者、27例十二指腸腫瘤患者、77例膽管癌患者、8例肝癌患者、22例胰腺炎患者、38例健康對(duì)照血漿中IL-18的表達(dá),并分析IL-18表達(dá)量與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系；免疫組織化學(xué)檢測(cè)112例胰腺癌及相應(yīng)癌旁正常胰腺組織中IL-18的表達(dá),并分析IL-18表達(dá)量與臨床病理、臨床分期以及預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果： 1. Ray Biotech Human Cytokine Array示差異性表達(dá)細(xì)胞因子23個(gè),其中胰腺癌患者血漿中高表達(dá)11個(gè)、低表達(dá)12個(gè),在高表達(dá)的細(xì)胞因子中,IL-18差異最明顯;胰腺癌組織基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示IL-18在胰腺癌與免疫系統(tǒng)的相互作用中可能發(fā)揮重要作用。 2.IL-18在胰腺癌患者血漿中的表達(dá)量相對(duì)胰腺良性腫瘤、十二指腸腫瘤、膽管癌、肝癌、胰腺炎患者高表達(dá)；在胰腺癌患者中,手術(shù)前3天IL-18的表達(dá)量要比手術(shù)后3天的高(p0.01)；IL-18的表達(dá)量與胰腺癌生存期呈正相關(guān)(p0.05)。 3.IL-18在胰腺癌組織中相對(duì)應(yīng)癌旁正常胰腺組織呈明顯的高表達(dá)(p0.001),且IL-18的表達(dá)量與是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移(p0.05)和AJCC臨床分期密切相關(guān)；IL-18在胰腺癌組織中的表達(dá)量與生存期呈負(fù)相關(guān)(p0.001)。 結(jié)論： 1. IL-18可能在胰腺癌與免疫系統(tǒng)的相互作用中發(fā)揮重要作用,可以作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。 2.IL-18在胰腺癌患者血漿中高表達(dá),且與生存期呈正相關(guān)；IL-18在胰腺癌組織中高表達(dá),且與生存期呈負(fù)相關(guān)。 第二部分單用IL-18對(duì)胰腺癌免疫治療作用的研究 目的：明確IL-18對(duì)常見免疫細(xì)胞亞群的影響,并確定重組IL-18對(duì)免疫功能正常和免疫缺陷的胰腺癌原位移植小鼠生存時(shí)間的影響。 方法： 1.分離健康志愿者PBMC,體外培養(yǎng),IL-18干預(yù)后,CCK-8檢測(cè)PBMC增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常見免疫細(xì)胞亞群的比例變化。 2.C57BL/6J鼠腹腔注射重組鼠IL-18一周,分離脾臟和腹腔淋巴結(jié)免疫細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常見免疫細(xì)胞亞群比例的變化。 3.構(gòu)建IL-18-/C57BL/6J鼠,分離脾臟和腹腔淋巴結(jié)免疫細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常見免疫細(xì)胞亞群比例的變化。 4.篩選8周大C57BL/6J鼠和Balb/c裸鼠,采用鼠胰腺癌細(xì)胞系LTPA構(gòu)建胰腺癌原位移植模型,鼠重組IL-18干預(yù),監(jiān)測(cè)小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)和生存時(shí)間。 結(jié)果： 1.IL-18可以促進(jìn)PBMC的增殖(p0.05),顯著增加Tc細(xì)胞(p0.001)和NK細(xì)胞(p0.05)細(xì)胞的比例。 2.IL-18顯著增加小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.相對(duì)于野生型C57BL/6J小鼠,IL-18基因敲出鼠脾臟和淋巴結(jié)中的Tc細(xì)胞(p0.05)和NK細(xì)胞(p0.05)細(xì)胞比例顯著下降。 4.在C57BL/6J鼠胰腺癌原位移植模型中,IL-18對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)曲線和生存曲線無(wú)影響;在Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模型中,IL-18干預(yù)組小鼠生存時(shí)間縮短(p0.01),更早開始出現(xiàn)體重下降等惡病質(zhì)表現(xiàn)。 結(jié)論： 1.IL-18在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例。 2.在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠胰腺癌原位移植模型中,單用重組IL-18并不能起到治療的作用；在免疫缺陷的Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模型中,重組IL-18干預(yù)反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,縮短荷瘤小鼠生存時(shí)間。 第三部分IL-18對(duì)胰腺癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的研究 目的：研究IL-18在體內(nèi)外對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響并探討其機(jī)制 方法： 1.構(gòu)建IL-18過(guò)表達(dá)、沉默慢病毒載體,轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系panc-1和mia-paca-2ψCCK-8實(shí)驗(yàn)、胰腺癌3D培養(yǎng)模型、transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-18在體外對(duì)胰腺癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響。人重組IL-18干預(yù)panc-1和mia-paca-2后,CCK-8實(shí)驗(yàn)、胰腺癌3D培養(yǎng)模型,transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-18在體外對(duì)胰腺癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響。 2.構(gòu)建Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型和胰腺癌Balb/c裸鼠脾臟種植肝轉(zhuǎn)移模型,監(jiān)測(cè)裸鼠移植瘤增長(zhǎng)情況和體重增長(zhǎng)情況,利用肝臟病理切片檢測(cè)其對(duì)胰腺癌體內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響。 3.基因芯片數(shù)據(jù)分析IL-18影響胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制；western blot、 EMSA、雙熒光報(bào)告素酶實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-18是否激活NF-κB信號(hào)通路；CCK-8實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-18是否通過(guò)NF-κB信號(hào)通路影響胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移；real-time PCR、ChIP、western blot實(shí)驗(yàn)確定IL-18激活NF-κB信號(hào)通路后的靶基因。 結(jié)果： 1.上調(diào)IL-18表達(dá)可顯著增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞系panc-1、mia-paca-2的體外增殖、侵襲、遷移能力,下調(diào)IL-18表達(dá)可抑制增殖、侵襲、遷移能力：人重組IL-18干預(yù)增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞系panc-1、mia-paca-2的體外增殖、侵襲、遷移能力；相對(duì)于對(duì)照組,結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.上調(diào)IL-18表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞系panc-1、mia-paca-2皮下移植瘤的生長(zhǎng),裸鼠在第5周逐漸出現(xiàn)體重下降等惡病質(zhì)表現(xiàn),下調(diào)IL-18表達(dá)顯著抑制皮下移植瘤的形成和生長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)裸鼠在8周實(shí)驗(yàn)內(nèi)體重穩(wěn)定增加；相對(duì)于對(duì)照組,結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.上調(diào)IL-18表達(dá)可增加胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶,顯著縮短荷瘤小鼠生存時(shí)間；下調(diào)IL-18表達(dá)可減少胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶,顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存時(shí)間；相對(duì)于對(duì)照組,結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.IL-18可以通過(guò)促進(jìn)IKKa/β的磷酸化激活NF-κB信號(hào)通路,IL-18通過(guò)NF-κB信號(hào)通路影響胰腺癌的增殖和侵襲,靶基因是MMP-3、MMP-9、c-myc和cyclin-D1, NF-κB信號(hào)通路阻滯劑BAY11-7082可以阻斷IL-18對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。 結(jié)論： 1.IL-18可以增強(qiáng)胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力。 2.IL-18調(diào)控NF-κB信號(hào)通路影響胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力,NF-κB言號(hào)通路阻滯劑BAY11-7082可以特異性阻斷IL-18對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。 第四部分選擇性阻斷其促瘤效應(yīng)后IL-18對(duì)胰腺癌免疫治療作用的研究 目的：研究選擇性阻斷IL-18對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用后,重組IL-18是否對(duì)胰腺癌具有免疫治療作用。 方法： 1.構(gòu)建沉默鼠IL-18慢病毒載體,轉(zhuǎn)染鼠胰腺癌細(xì)胞系LTPA,C57BL/6J和IL-18-/-C57BL/6J小鼠構(gòu)建鼠胰腺癌原位移植模型,分為四個(gè)組i)LTPA/C57BL/6J、ⅱ) IL-18KD/C57BL/6J.ⅲ)LTPA/IL-18-/-C57BL/6J、ⅳ)IL-18KD/IL-18-/-C57BL/6J,監(jiān)測(cè)生存時(shí)間,生長(zhǎng)狀態(tài),肝臟、肺臟病理切片檢測(cè)遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移灶。 2.采用鼠胰腺癌細(xì)胞系LTPA和C57BL/6J小鼠,構(gòu)建鼠胰腺癌原位抑制模型,分為四個(gè)組i)PBS.ⅱ)IL-18.ⅲ)BAY11-7082.ⅳ)IL-18聯(lián)合BAY11-7082,監(jiān)測(cè)生存時(shí)間和生長(zhǎng)狀態(tài)。 結(jié)果： 1.IL-18KD/C57BL/6J組小鼠長(zhǎng)期生存,生長(zhǎng)狀態(tài)最好;LTPA/IL-18-/-C57BL/6J生存時(shí)間最短,生存狀態(tài)最差,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟和肺臟HE病理切片示IL-18KD/C57BL/6J組小鼠無(wú)微轉(zhuǎn)移灶,LTPA/IL-18-/-C57BL/6J組小鼠肝臟、肺臟微轉(zhuǎn)移灶最多,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.IL-18聯(lián)合BAY11-7082組小鼠可以長(zhǎng)期生存,其他三組生存時(shí)間和生存狀態(tài)無(wú)明顯差異；IL-18聯(lián)合BAY11-7082組與其他三組相比,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：只有采用BAY11-7082選擇性阻斷IL-18對(duì)胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用后,IL-18才能顯著改善胰腺癌荷瘤小鼠生存狀態(tài)、延長(zhǎng)生存時(shí)間,起到免疫治療的作用。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：2412113