【摘要】：研究背景和研究目的膽管癌根據(jù)其發(fā)生部位的差別,可以分為肝內(nèi)膽管細胞癌和肝外膽管細胞癌。其中肝內(nèi)膽管細胞癌的發(fā)生率要低于肝外膽管細胞癌,但是肝內(nèi)膽管細胞癌起病隱匿,早期癥狀往往不明顯,導致患者就診時可能已經(jīng)失去根治性手術(shù)切除的機會。而肝內(nèi)膽管細胞癌對于目前的常規(guī)化療藥物敏感性欠佳,且患者耐受性較差,放射治療也多只是姑息性治療。因此,發(fā)現(xiàn)一種不良反應(yīng)較輕且療效顯著的新藥是十分必要的。雙胍類藥物是在糖尿病治療中的常用藥物,其安全性經(jīng)過多年的驗證是可靠的。流行病學資料顯示,糖尿病與腫瘤患病率和死亡率相關(guān),橫斷面及回顧性研究也提示,2型糖尿病患者服用二甲雙胍可降低腫瘤患病率、提高化療反應(yīng)及減少病死率。與二甲雙胍相似苯乙雙胍也屬于雙胍類藥物,也曾用于糖尿病的治療,但由于其乳酸堆積的副作用較明顯而禁用。然而,對于腫瘤治療而言,苯乙雙胍療效更佳,并且腫瘤治療與糖尿病治療的標準亦有所不同。因此對于腫瘤治療苯乙雙胍是更好的選擇。雙胍類藥物的作用靶點是AMPK,而AMPK是LKB1的直接底物,這也預(yù)示著LKB1的表達變化有可能對雙胍類藥物治療腫瘤的效果產(chǎn)生重要影響。因此我們希望研究苯乙雙胍對于肝內(nèi)膽管細胞癌的抗癌作用,并通過LKB1 AMPK通路來研究苯乙雙胍的抗癌機制及LKB1的表達狀態(tài)對于苯乙雙胍療效的影響。研究方法1.CCK-8實驗檢測不同濃度的苯乙雙胍對于肝內(nèi)膽管細胞癌RBE、HuH-28細胞系的增殖抑制作用,并計算其IC 50;CCK-8實驗檢測相同濃度苯乙雙胍不同作用時間對于RBE、HuH-28細胞的增殖抑制作用。2.以不同濃度苯乙雙胍干預(yù)RBE、HuH-28細胞,用流式細胞儀檢測其對凋亡的影響。3.以苯乙雙胍干預(yù)RBE細胞,通過Western Blot檢測苯乙雙胍對LKB1、AMPK、p AMPK蛋白表達的影響。4.以不同濃度苯乙雙胍干預(yù)RBE、HuH-28細胞,用酶標儀檢測兩種細胞的培養(yǎng)基,檢測其PH值、葡萄糖含量、乳糖含量的變化。5.分別用高糖、低糖、低糖加乳酸這三種培養(yǎng)基培養(yǎng)RBE、HuH-28細胞,并用苯乙雙胍進行干預(yù),檢測不同培養(yǎng)基對苯乙雙胍療效的影響。6.用LKB1 SiRNA敲減RBE細胞的LKB1基因,并用Western Blot方法檢測敲減效果。7.用ki67免疫熒光檢測lkb1基因敲減對rbe細胞增殖的影響。8.以苯乙雙胍干預(yù)野生型及l(fā)kb1敲減的rbe細胞,用cck-8檢測苯乙雙胍對兩種細胞增殖的影響。9.以苯乙雙胍干預(yù)野生型及l(fā)kb1敲減的rbe細胞,用流式細胞儀檢測苯乙雙胍對兩種細胞凋亡的影響。10.以苯乙雙胍干預(yù)野生型及l(fā)kb1敲減的rbe細胞,用westernblot檢測兩種細胞p-ampk的表達。11.以苯乙雙胍干預(yù)野生型及l(fā)kb1敲減的rbe細胞,用westernblot檢測兩種細胞bax、cleaved caspase3的表達。結(jié)果1.隨著苯乙雙胍濃度的增加,作用時間的延長,rbe、huh-28細胞的存活率逐漸降低,苯乙雙胍對rbe、huh-28兩種細胞的ic50分別為1138μm和854μm。2.隨著苯乙雙胍濃度的增加,rbe、huh-28細胞的凋亡率逐漸增加。3.rbe細胞接受苯乙雙胍(500μm)處理12、24、36h之后,ampk的表達并無明顯變化,lkb1的表達有增加但不明顯,而p-ampk的表達明顯增加。4.兩種細胞的培養(yǎng)基隨苯乙雙胍的濃度增加均出現(xiàn)一定程度的酸化,糖含量均逐漸降低,乳酸含量均逐漸增加。5.對照組(不加苯乙雙胍),無論在高糖、低糖還是低糖+乳酸的培養(yǎng)基中存活率都無顯著差別,而實驗組(苯乙雙胍干預(yù))在高糖、低糖、低糖+乳酸三種培養(yǎng)基下,細胞存活率依次下降。6.westernblot顯示lkb1sirna干預(yù)的rbe細胞其lkb1的表達明顯下降。7.lkb1敲減組的rbe細胞增殖更明顯。8.lkb1敲減后的rbe細胞在無苯乙雙胍干預(yù)時增殖較野生型增加。而使用苯乙雙胍干預(yù)后,lkb1敲減的rbe細胞增殖速度顯著低于野生型的rbe細胞。9.lkb1敲減后rbe細胞的凋亡率低于野生型的細胞。野生型和lkb1敲減的rbe細胞用苯乙雙胍干預(yù)后凋亡率均增加,但lkb1敲減的rbe細胞凋亡率增加更明顯。10.苯乙雙胍干預(yù)下lkb1敲減型的rbe細胞p-ampk表達明顯低于野生型rbe細胞。11.野生型rbe細胞與lkb1敲減的rbe細胞在苯乙雙胍干預(yù)下均會增加bax、cleaved-caspase3基因的表達,但lkb1敲減的細胞增加更明顯。結(jié)論通過本次實驗,我們研究了苯乙雙胍對于肝內(nèi)膽管細胞癌RBE、HuH-28細胞增殖、凋亡、能量代謝的影響,并從LKB1-AMPK通路的角度研究了其作用機制。另外我們通過敲減LKB1基因發(fā)現(xiàn)其可以影響苯乙雙胍對膽管癌的作用效果,并簡單探討了其可能的機制。我們得出以下結(jié)論:1.苯乙雙胍可以抑制肝內(nèi)膽管細胞癌RBE、HuH-28細胞的增殖,并增加其凋亡,并且這一作用呈現(xiàn)時間劑量依賴性。2.苯乙雙胍能活化AMPK,使之成為磷酸化的AMPK(p-AMPK),苯乙雙胍的抗癌作用可能與LKB1 AMPK通路有關(guān)。3.隨著苯乙雙胍濃度的增加,細胞合成代謝受抑制,分解代謝增強,糖酵解增加,代謝產(chǎn)物堆積,培養(yǎng)基酸化。處于低糖,代謝產(chǎn)物堆積微環(huán)境中的細胞對苯乙雙胍更敏感。4.LKB1為一抑癌基因,LKB1敲減后RBE細胞增殖加快。5.LKB1表達降低的細胞對苯乙雙胍更敏感,而苯乙雙胍增加LKB1敲減型細胞凋亡增加的原因可能與Bax、cleaved caspase3表達增加有關(guān)。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.8

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本文編號：2405849