【摘要】：食管癌(esophageal cancer,EC)是世界范圍第八大最為常見(jiàn)的惡性腫瘤,每年估計(jì)有450,000新發(fā)生的病例和400,000死亡的病例。EC具有兩種主要的組織學(xué)類型,即鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和腺癌(adenocarcinoma,AC),其主要的差別在于發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)、腫瘤生物學(xué)、預(yù)后及治療手段的不同。目前,針對(duì)食管癌病人常常采用多種不同模式的治療手段,即食管切除術(shù)聯(lián)合手術(shù)期間的化療或輔助的放化療已經(jīng)證實(shí)能改善病人的預(yù)后,因而成為EC病人標(biāo)準(zhǔn)的治療手段。然而,由于腫瘤侵襲的特性及缺乏有效的個(gè)體治療方法,EC病人的預(yù)后仍然很差,其5年生存率僅保持在36%-47%。因此發(fā)展EC新的治療手段和尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)于改善EC病人的預(yù)后具有十分重要的價(jià)值。人前梯度基因2(Anterior gradient 2,AGR2)是爪蟾粘腺蛋白XAG-2的一種同源類似物。AGR2基因主要定位于人染色體7p21.3區(qū)域,由8個(gè)外顯子和9個(gè)轉(zhuǎn)錄本構(gòu)成,屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族成員之一,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)中。目前,AGR2的過(guò)表達(dá)已經(jīng)在多種不同的腫瘤中被報(bào)道,它能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和惡性轉(zhuǎn)化。最為重要的是,AGR2作為潛在的有希望的診斷標(biāo)志也已經(jīng)被證實(shí),并可能成為腫瘤新的預(yù)后因子。這些研究充分表明,AGR2可能在多種不同的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用,因而可能成為許多腫瘤潛在的分子治療靶點(diǎn)和預(yù)后因子。然而,AGR2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚,為了進(jìn)一步探討AGR2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用,本研究首先采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分析食管鱗癌組織和細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的表達(dá),分析其表達(dá)與食管鱗癌病人臨床病理學(xué)參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系。進(jìn)一步將AGR2siRNA和siRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC1細(xì)胞,研究其表達(dá)下調(diào)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和侵襲的影響,該研究旨在為以AGR2為靶點(diǎn)的食管鱗癌的基因治療提供理論依據(jù)。方法(1)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)97例食管鱗癌組織和對(duì)應(yīng)的正常食管上皮組織中AGR2蛋白的表達(dá)。(2)利用SPSS17.0軟件分析AGR2蛋白的表達(dá)與食管鱗癌病人臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系。(3)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)隨機(jī)選擇的8例食管鱗癌組織和對(duì)應(yīng)的正常食管上皮組織中AGR2 mRNA的表達(dá)。(4)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)不同食管鱗癌細(xì)胞和正常食管上皮細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的表達(dá)。(5)利用脂質(zhì)體2000,將AGR2 siRNA和siRNA對(duì)照分別轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC1細(xì)胞,并將細(xì)胞分為三組:未處理組、siRNA對(duì)照組和AGR2 siRNA組。(6)利用CCK-8試劑檢測(cè)不同處理組別的食管鱗癌EC1細(xì)胞增殖能力的變化。(7)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組別的食管鱗癌EC1細(xì)胞周期分布的變化。(8)利用Transwell小室檢測(cè)不同處理組別的食管鱗癌EC1細(xì)胞侵襲能力的變化。(9)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:上述所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組織化學(xué)的結(jié)果采用卡方檢驗(yàn),AGR2蛋白表達(dá)與食管鱗癌病人預(yù)后之間的關(guān)系采用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。對(duì)于兩組之間的比較采用t檢驗(yàn),對(duì)于3組及以上的比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果(1)AGR2在食管鱗癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率(82/97,84.5%)顯著高于對(duì)應(yīng)的正常食管上皮組織(11/97,11.3%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(c2=104.115,P0.05)。(2)隨機(jī)選擇的8例食管鱗癌組織中AGR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于其對(duì)應(yīng)的8例正常食管上皮組織,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)AGR2蛋白表達(dá)與食管鱗癌病人的性別和年齡均無(wú)關(guān)(均P0.05),但與組織學(xué)分化、臨床分期以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(所有P0.05)。(4)Log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)的結(jié)果表明,AGR2的表達(dá)與食管鱗癌病人的預(yù)后之間存在明顯的相關(guān)性,AGR2高表達(dá)的食管鱗癌病人的存活時(shí)間顯著低于AGR2低表達(dá)的食管鱗癌病人,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)3株食管鱗癌細(xì)胞株(EC1、Eca109和EC9706)中AGR2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于正常食管上皮細(xì)胞Het-1A,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。最為重要的是,食管鱗癌EC1細(xì)胞中AGR2 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于其它所研究的細(xì)胞,且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)與未處理組和siRNA對(duì)照組相比,AGR2 siRNA組中AGR2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平顯著下調(diào),且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(7)與未處理組和siRNA對(duì)照組相比,AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞的增殖能力顯著被抑制,且差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(8)AGR2 si RNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)的比率為64.77±1.12%,顯著高于未處理的EC1細(xì)胞(52.48±1.26%)和siRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染的EC1細(xì)胞(52.29±1.24%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.850,P0.05)。進(jìn)一步分析表明,AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞在S期的細(xì)胞數(shù)的比率為21.71±0.87%,顯著低于未處理的EC1細(xì)胞(29.09±0.71%)和siRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染的EC1細(xì)胞(29.40±1.91%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.859,P0.05)。此外,AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞在G2/M期的細(xì)胞數(shù)的比率為13.52±1.89%,顯著低于未處理的EC1細(xì)胞(18.43±1.63%)和siRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染的EC1細(xì)胞(18.31±1.11%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.437,P0.05)。(9)AGR2 siRNA組中食管鱗癌EC1細(xì)胞的穿膜數(shù)為52.67±15.01,顯著低于未處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞(132.67±16.50)和siRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染的食管鱗癌EC1細(xì)胞(125.33±14.57),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.791,P0.05)。結(jié)論(1)AGR2在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可能發(fā)揮癌基因的作用,并可能成為食管鱗癌新的預(yù)后因子。(2)AGR2表達(dá)下調(diào)能介導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期分布改變和侵襲能力下降,因而抑制AGR2的表達(dá)可能成為食管鱗癌新的治療策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1
，

本文編號(hào)：2404082