【摘要】：目的(1)篩選胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS穩(wěn)定感染EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)后差異表達(dá)的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA),為探討EBV的致瘤機(jī)制提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。(2)明確EBV陽性和陰性胃癌細(xì)胞系以及組織標(biāo)本中l(wèi)nc RNA H19的表達(dá)水平及差異;探討EBV感染對(duì)胃癌組織中H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平、H19印記狀態(tài)的影響。方法(1)采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)對(duì)AGS細(xì)胞系和穩(wěn)定感染EBV的AGS-EBV細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。(2)對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,包括lnc RNAs表達(dá)水平分析、差異表達(dá)lnc RNAs的靶基因預(yù)測(cè),以及預(yù)測(cè)靶基因的GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。(3)采用實(shí)時(shí)熒光定量q RT-PCR檢測(cè)EBV陽性胃癌細(xì)胞系(GT-38、GT-39、SNU719、AGS-EBV)、EBV陰性胃癌細(xì)胞系(MKN-45、SGC7901、HGC-27、AGS)、EBVa GC及EBVn GC組織中l(wèi)nc RNA H19的表達(dá)水平。(4)亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序法(bisulfate genomic sequencing,BGS)及sequenom Mass Array飛行質(zhì)譜法檢測(cè)EBV陽性及陰性胃癌細(xì)胞系、EBVa GC及EBVn GC組織中H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài);結(jié)合檢測(cè)區(qū)434G/T多態(tài)性位點(diǎn),對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)434G/T雜合型標(biāo)本進(jìn)行H19啟動(dòng)子區(qū)等位基因特異性甲基化分析。(5)依據(jù)H19第5外顯子區(qū)有單一的RsaⅠ多態(tài)性酶切位點(diǎn),采用限制性片段長度多態(tài)性(restrictive fragment length polymorphisms,RFLP)結(jié)合PCR技術(shù)(RFLP-PCR)檢測(cè)EBVa GC和EBVn GC組織中H19基因的印記狀態(tài)。結(jié)果(1)與AGS細(xì)胞系相比,AGS-EBV細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)879條差異表達(dá)的lnc RNAs,包括47條表達(dá)上調(diào),832條表達(dá)下調(diào);其中24條lnc RNAs在AGS中不表達(dá),243條lnc RNAs在AGS-EBV中不表達(dá)。差異表達(dá)的lnc RNAs中有腫瘤相關(guān)性lnc RNAs,如H19和CCAT1已經(jīng)證明與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。(2)部分差異表達(dá)的lnc RNAs預(yù)測(cè)到靶基因,通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的靶基因參與了多種生物學(xué)過程(biological_process)、細(xì)胞成分的組成(cellular_component)及分子功能(molecular_function)。有些lnc RNA的靶基因與凋亡過程(apoptotic process)、細(xì)胞周期阻滯(cell cycle arrest)及細(xì)胞增殖(cell proliferation)等密切相關(guān)。靶基因的KEGG分析結(jié)果顯示,這些靶基因主要參與氧化磷酸化、代謝途徑、內(nèi)吞作用、唾液腺分泌、胰腺分泌及某些代謝性疾病如Alzheimer癥、Huntington病和Parkinson病等途徑。(3)4種EBV陽性細(xì)胞系lnc RNA H19平均表達(dá)水平明顯低于4種EBV陰性細(xì)胞系(0.04789±0.02991 vs 4.061±0.4192,P0.001);EBVa GC組織中l(wèi)nc RNA H19的平均表達(dá)水平明顯低于EBVn GC(0.7024±0.4000 vs 3.646±0.7058,P0.001)。(4)EBV陽性細(xì)胞系H19啟動(dòng)子均呈高甲基化狀態(tài),而EBV陰性細(xì)胞系僅個(gè)別Cp G位點(diǎn)呈甲基化狀態(tài),EBV陽性細(xì)胞系H19啟動(dòng)子Cp G甲基化率明顯高于EBV陰性組。BGS法及質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果顯示21例EGVa GC及17例EBVn GC組織標(biāo)本中H19啟動(dòng)子平均甲基化率均接近50%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.7791,P=0.729);兩組間高甲基化及低甲基化標(biāo)本組成也無顯著性差異(P=0.721)。對(duì)EBVa GC及EBVn GC組織中434G/T雜合性標(biāo)本(各5例)進(jìn)行了等位基因差異性甲基化分析,結(jié)果顯示EBVa GC組織中,一條等位基因保持幾乎均完全甲基化狀態(tài),另一條等位基因亦出現(xiàn)了不同程度的甲基化,其中PL455兩條等位基因均幾乎完全甲基化;EBVn GC組標(biāo)本一條等位基因保持幾乎均完全甲基化狀態(tài),另一條等位基因保持幾乎完全未甲基化狀態(tài),但Q589兩條等位基因均幾乎完全未甲基化,EBVa GC組H19啟動(dòng)子甲基化程度高于EBVn GC組。(5)自39例EBVa GC及86例EBVn GC標(biāo)本中分別篩選出H19第5外顯子區(qū)RsaⅠ多態(tài)性酶切位點(diǎn)雜合型標(biāo)本24例及28例;有6例EBVa GC組織中(25%,6/24)H19呈雙等位基因表達(dá),EBVn GC中亦有6例(21.43%,6/28)H19呈雙等位基因表達(dá),兩組間H19印記丟失率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.00)。結(jié)論(1)EBV穩(wěn)定感染AGS細(xì)胞系可導(dǎo)致宿主細(xì)胞lnc RNAs表達(dá)水平發(fā)生改變,以表達(dá)下調(diào)的lnc RNAs居多。部分差異表達(dá)的lnc RNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。(2)差異表達(dá)的lnc RNAs參與了多種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng),提示EBV可以通過lnc RNA進(jìn)一步作用于其靶基因,進(jìn)而更廣泛地影響宿主基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,參與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。(3)EBV感染對(duì)胃癌細(xì)胞中l(wèi)nc RNA H19的表達(dá)具有顯著影響,EBV可能通過調(diào)控lnc RNA H19的表達(dá)參與EBVa GC的發(fā)生與發(fā)展。(4)EBV陽性細(xì)胞系H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平明顯高于EBV陰性細(xì)胞系,啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與lnc RNA H19的表達(dá)水平密切相關(guān),是調(diào)控H19表達(dá)的重要因素。但EBVa GC和EBVn GC組織中H19啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度無顯著性差異,提示體內(nèi)除啟動(dòng)子甲基化外,尚有其它因素參與H19轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控。(5)胃癌組織中存在一定比例的H19印記丟失,這可能是胃癌組織中H19表達(dá)水平增高的原因之一,EBV感染對(duì)胃癌組織中H19基因的印記丟失無明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2400943