【摘要】：目的(1)篩選胃癌細胞系AGS穩(wěn)定感染EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)后差異表達的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA),為探討EBV的致瘤機制提供理論及實驗基礎。(2)明確EBV陽性和陰性胃癌細胞系以及組織標本中l(wèi)nc RNA H19的表達水平及差異;探討EBV感染對胃癌組織中H19啟動子區(qū)甲基化水平、H19印記狀態(tài)的影響。方法(1)采用高通量轉錄組測序(RNA-Seq)技術對AGS細胞系和穩(wěn)定感染EBV的AGS-EBV細胞系進行轉錄組測序。(2)對獲得的測序數據進行生物信息學分析,包括lnc RNAs表達水平分析、差異表達lnc RNAs的靶基因預測,以及預測靶基因的GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。(3)采用實時熒光定量q RT-PCR檢測EBV陽性胃癌細胞系(GT-38、GT-39、SNU719、AGS-EBV)、EBV陰性胃癌細胞系(MKN-45、SGC7901、HGC-27、AGS)、EBVa GC及EBVn GC組織中l(wèi)nc RNA H19的表達水平。(4)亞硫酸氫鹽基因組測序法(bisulfate genomic sequencing,BGS)及sequenom Mass Array飛行質譜法檢測EBV陽性及陰性胃癌細胞系、EBVa GC及EBVn GC組織中H19啟動子區(qū)甲基化狀態(tài);結合檢測區(qū)434G/T多態(tài)性位點,對多態(tài)性位點434G/T雜合型標本進行H19啟動子區(qū)等位基因特異性甲基化分析。(5)依據H19第5外顯子區(qū)有單一的RsaⅠ多態(tài)性酶切位點,采用限制性片段長度多態(tài)性(restrictive fragment length polymorphisms,RFLP)結合PCR技術(RFLP-PCR)檢測EBVa GC和EBVn GC組織中H19基因的印記狀態(tài)。結果(1)與AGS細胞系相比,AGS-EBV細胞系中發(fā)現879條差異表達的lnc RNAs,包括47條表達上調,832條表達下調;其中24條lnc RNAs在AGS中不表達,243條lnc RNAs在AGS-EBV中不表達。差異表達的lnc RNAs中有腫瘤相關性lnc RNAs,如H19和CCAT1已經證明與多種腫瘤的發(fā)生有關。(2)部分差異表達的lnc RNAs預測到靶基因,通過GO富集分析發(fā)現預測的靶基因參與了多種生物學過程(biological_process)、細胞成分的組成(cellular_component)及分子功能(molecular_function)。有些lnc RNA的靶基因與凋亡過程(apoptotic process)、細胞周期阻滯(cell cycle arrest)及細胞增殖(cell proliferation)等密切相關。靶基因的KEGG分析結果顯示,這些靶基因主要參與氧化磷酸化、代謝途徑、內吞作用、唾液腺分泌、胰腺分泌及某些代謝性疾病如Alzheimer癥、Huntington病和Parkinson病等途徑。(3)4種EBV陽性細胞系lnc RNA H19平均表達水平明顯低于4種EBV陰性細胞系(0.04789±0.02991 vs 4.061±0.4192,P0.001);EBVa GC組織中l(wèi)nc RNA H19的平均表達水平明顯低于EBVn GC(0.7024±0.4000 vs 3.646±0.7058,P0.001)。(4)EBV陽性細胞系H19啟動子均呈高甲基化狀態(tài),而EBV陰性細胞系僅個別Cp G位點呈甲基化狀態(tài),EBV陽性細胞系H19啟動子Cp G甲基化率明顯高于EBV陰性組。BGS法及質譜法檢測結果顯示21例EGVa GC及17例EBVn GC組織標本中H19啟動子平均甲基化率均接近50%,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.7791,P=0.729);兩組間高甲基化及低甲基化標本組成也無顯著性差異(P=0.721)。對EBVa GC及EBVn GC組織中434G/T雜合性標本(各5例)進行了等位基因差異性甲基化分析,結果顯示EBVa GC組織中,一條等位基因保持幾乎均完全甲基化狀態(tài),另一條等位基因亦出現了不同程度的甲基化,其中PL455兩條等位基因均幾乎完全甲基化;EBVn GC組標本一條等位基因保持幾乎均完全甲基化狀態(tài),另一條等位基因保持幾乎完全未甲基化狀態(tài),但Q589兩條等位基因均幾乎完全未甲基化,EBVa GC組H19啟動子甲基化程度高于EBVn GC組。(5)自39例EBVa GC及86例EBVn GC標本中分別篩選出H19第5外顯子區(qū)RsaⅠ多態(tài)性酶切位點雜合型標本24例及28例;有6例EBVa GC組織中(25%,6/24)H19呈雙等位基因表達,EBVn GC中亦有6例(21.43%,6/28)H19呈雙等位基因表達,兩組間H19印記丟失率無統(tǒng)計學差異(P=1.00)。結論(1)EBV穩(wěn)定感染AGS細胞系可導致宿主細胞lnc RNAs表達水平發(fā)生改變,以表達下調的lnc RNAs居多。部分差異表達的lnc RNA與腫瘤的發(fā)生密切相關。(2)差異表達的lnc RNAs參與了多種細胞生物學活動,提示EBV可以通過lnc RNA進一步作用于其靶基因,進而更廣泛地影響宿主基因的轉錄調控,參與EBV相關腫瘤的發(fā)生發(fā)展。(3)EBV感染對胃癌細胞中l(wèi)nc RNA H19的表達具有顯著影響,EBV可能通過調控lnc RNA H19的表達參與EBVa GC的發(fā)生與發(fā)展。(4)EBV陽性細胞系H19啟動子區(qū)甲基化水平明顯高于EBV陰性細胞系,啟動子區(qū)甲基化程度與lnc RNA H19的表達水平密切相關,是調控H19表達的重要因素。但EBVa GC和EBVn GC組織中H19啟動子區(qū)甲基化程度無顯著性差異,提示體內除啟動子甲基化外,尚有其它因素參與H19轉錄表達的調控。(5)胃癌組織中存在一定比例的H19印記丟失,這可能是胃癌組織中H19表達水平增高的原因之一,EBV感染對胃癌組織中H19基因的印記丟失無明顯影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

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本文編號：2400943