發(fā)布時間：2019-01-04 20:59

【摘要】：盡管近年來發(fā)病率有所降低,在全球范圍內(nèi),胃癌依舊是致死率全球第五的高度惡性的腫瘤。盡管消化道內(nèi)鏡檢查已引入到胃癌早期臨床診斷過程中,仍有65%的患者首診就發(fā)現(xiàn)有胃癌的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移,且進展期胃癌患者的5年生存率低至5%-15%。侵襲與轉(zhuǎn)移、術(shù)后復發(fā)和多藥耐藥均被認為是胃癌患者預后不良,術(shù)后生存時間短的重要原因。胃癌,這一消化道惡性腫瘤的諸多惡性生物學行為其背后的分子機制至今仍不清楚。而報道已證實,轉(zhuǎn)錄因子RUNX2參與促進多種易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移行為的發(fā)生,同時,我們的實驗發(fā)現(xiàn)RUNX2在胃癌干細胞中高表達,因此,我們的研究旨在揭示RUNX2在促進胃癌細胞惡性生物學行為及其分子機制。經(jīng)大樣本臨床免疫組化檢測分析發(fā)現(xiàn),RUNX2是胃癌患者預后的一個極為重要的提示因子。與此同時,一系列的體外實驗和原位移植瘤動物模型的數(shù)據(jù)證實,RUNX2是維持胃癌細胞移植瘤成瘤及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性行為的重要因子。因此,為了明確此作用內(nèi)在的分子機制,我們進行了染色質(zhì)免疫共沉淀和雙熒光素酶報告實驗,結(jié)果證實,轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的轉(zhuǎn)錄激活位點落在CXCR4的啟動子區(qū)上。CXCR4是RUNX2下游極為重要的靶基因,在胃癌中,RUNX2主要通過激活CXCR4的轉(zhuǎn)錄和表達,發(fā)揮促進胃癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。接著,我們通過采用慢病毒干擾下調(diào)CXCR4或添加AMD3100處理的方法,在RUNX2高表達的情況下抑制CXCR4信號通路的活化。由此,我們通過體內(nèi)外的實驗證實,抑制CXCR4信號通路的活性可逆轉(zhuǎn)由RUNX2所介導促侵襲轉(zhuǎn)移的作用。因此,RUNX2可作為一個有價值的臨床腫瘤診療因子,可預示患者的預后,同時RUNX2/CXCR4通路的揭示為我們提供了第一手實驗室證據(jù),是今后針對該通路進行的靶向藥物研發(fā)的重要依據(jù)。主要方法,研究結(jié)果和結(jié)論如下:1.RUNX2在胃癌干細胞和胃癌細胞中的表達。(1)通過比較成球狀態(tài)胃癌細胞和單層培養(yǎng)的胃癌細胞的DNA表達譜芯片結(jié)果后發(fā)現(xiàn),RUNX2在成球狀態(tài)胃癌細胞中顯著高表達50余倍。通過無血清成球培養(yǎng)法,常被認為是富集胃癌干細胞(GCSCs)的主要方法。(2)基于以上基因芯片結(jié)果,我們采用GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)方法進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn),以RUNX2為核心的一群基因簇群(共同代表著一類生物學功能)在胃癌干細胞中為顯著活化的狀態(tài),在gsea中獲高的富集得分。(3)通過免疫熒光染色觀察后發(fā)現(xiàn),runx2在成球培養(yǎng)的胃癌細胞中高表達。(4)與此同時,runx2在sgc7901,mgc803和xn0422中均被檢測后發(fā)現(xiàn),runx2在sgc7901細胞中低表達,在mgc803和xn0422細胞中顯著高表達。2.胃癌中,runx2的表達與胃癌臨床病理參數(shù)和患者的預后密切相關(guān)。(1)共305例有完全隨訪信息的胃癌病理標本的免疫組化發(fā)現(xiàn),runx2與臨床病理參數(shù),如tnm分級、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移和侵潤深度正相關(guān)。runx2主要定位在胃癌細胞核內(nèi),僅少部分表達呈現(xiàn)胞核胞漿同時表達,且在不同分化程度的胃癌中,其表達具有統(tǒng)計學意義(p=0.006)。在81例高/中分化胃癌中,有49例(60.5%)的患者高表達runx2,這一比例在低分化胃癌病例中,runx2高表達比例占總?cè)后w的76.3%(171/224)。同時,runx2的高低表達與胃癌患者的tnm分期正相關(guān)(p=0.000)。在tnmi期和ii期的共124位胃癌患者中,有49位患者被檢測出具有runx2的低表達(49/124,39.5%),75例患者則為runx2的高表達(75/124,60.5%)。然而,在181例tnmiii期和iv期的胃癌患者人群中,有145例患者表現(xiàn)出runx2高表達(145/181,80.1%)。此外,runx2的高表達還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.000)和深部浸潤(p=0.000)相關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中,大約79.3%的患者被檢出runx2高表達(161/203)。而在發(fā)現(xiàn)漿膜浸潤的胃癌患者中,超過79.1%的患者有runx2的高表達(178/225)。最后,runx2的表達與患者的年齡(p=0.352)和性別(p=0.480)無關(guān)。(2)比較胃癌癌組織和癌旁組織runx2的表達也發(fā)現(xiàn),在癌組織中,runx2高表達的比例為72.1%(220/305),而癌旁組織該比例僅為21.6%(66/305)(p=0.00);(3)在305例胃癌病例中,有220例呈runx2高表達狀態(tài)。高表達的胃癌患者群體總體預后不良,術(shù)后生存時間短。runx2低表達的患者預后好,有較長的術(shù)后生存期。以上研究證實,runx2表達水平提示胃癌患者的總體預后;(4)通過多因素分析的方法發(fā)現(xiàn),runx2表達(hr3.454,95%ci1.408-8.230,p=0.007),與淋巴轉(zhuǎn)移(hr1.539,95%ci1.089-2.591,p=0.045)和侵潤深度(hr1.620,95%ci1.022-2.567,p=0.040)共同預示患者的預后情況,數(shù)據(jù)顯示tnm分期(hr1.293,95%ci0.846-1.975,p=0.235)和分化程度(hr0.704,95%ci0.488-1.016,p=0.061)這一指標似無作用,分析原因可能為采集的樣本例數(shù)較少。.3.runx2促進胃癌細胞移植瘤成瘤及體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移。(1)runx2參與胃癌移植瘤成瘤能力維持。通過將胃癌細胞系移植于裸鼠皮下,進行移植瘤成瘤實驗證實,在穩(wěn)定上調(diào)runx2表達的胃癌細胞株sgc7901-exrunx2中,其皮下移植瘤成瘤能力顯著增強。移植瘤重量與大小的統(tǒng)計分析結(jié)果也證實了以上結(jié)論。(2)runx2促進胃癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。體外細胞劃痕實驗用于評估胃癌細胞的平面遷移運動能力。試驗結(jié)果證實,在sgc7901中穩(wěn)定上調(diào)runx2后,腫瘤細胞遷移的距離遠大于對照組細胞(control)。而在mgc803和原代細胞xn0422中穩(wěn)定敲低runx2的表達后,細胞遷移距離縮短,提示遷移能力受損。侵襲實驗也證實,runx2的表達與細胞體外侵襲能力正相關(guān)。同時,匯總綜合國內(nèi)外文獻的方法,基于胃癌發(fā)生發(fā)展的規(guī)律,改良了胃癌原位移植瘤的裸鼠模型,并通過該動物模型證實,runx2上調(diào)后,胃癌細胞在胃部的局部侵襲能力顯著增強,可向鄰近肝臟轉(zhuǎn)移。穩(wěn)定敲低runx2后,胃癌細胞的局部侵襲與肝臟轉(zhuǎn)移能力顯著受損。因此,runx2在體內(nèi)外均促胃癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移。4.轉(zhuǎn)錄因子runx2直接轉(zhuǎn)錄激活cxcr4基因。(1)通過采用轉(zhuǎn)錄因子生物信息學分析預測對與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因進行評分后發(fā)現(xiàn),cxcr4的得分最高(11.462)。通過real-timepcr在mgc803和原代細胞xn0422中對與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因進行篩選后發(fā)現(xiàn),cxcr4差異倍數(shù)最高,且是兩種細胞中均降低的分子。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因包括,mmp家族成員,趨化因子受體cxcr4以及emt現(xiàn)象相關(guān)基因,其中,mmps在諸多腫瘤,如骨肉瘤,乳腺癌和前列腺癌中被報道是runx2的下游靶基因。(2)通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),在cxcr4啟動子區(qū)上存在一段277堿基的片段,高度疑似runx2的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。(3)基于生物信息學預測的結(jié)果所提示的15bp的片段,我們設(shè)計了突變型的熒光素酶報告載體。熒光素酶報告試驗及后續(xù)的凝膠電泳遷移率試驗證實,這15個堿基的片段,正是轉(zhuǎn)錄因子runx2在cxcr4基因啟動子區(qū)結(jié)合的位點。(4)與此同時,我們還對之前ch-ip試驗所明確的277個堿基片段進行50個堿基的遞增分段截短構(gòu)建相應的熒光素酶報告載體,后續(xù)的熒光素酶報告試驗證實第一個被截短的50個堿基內(nèi)存在runx2的結(jié)合位點。而這一結(jié)論,與先前的試驗結(jié)果相一致。(5)最后,wb檢測發(fā)現(xiàn),cxcr4的表達與runx2水平的正相關(guān)關(guān)系。5.cxcr4是runx2調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要的下游因子。(1)在runx2上調(diào)的同時,我們通過穩(wěn)定敲低cxcr4或用cxcr4信號通路特異性抑制劑amd3100的方法抑制cxcr4信號通路活化,趨化實驗證實胃癌細胞趨化遷移能力顯著受損。(2)細胞侵襲試驗證實,細胞侵襲能力受cxcr4信號通路抑制而受損。(3)抑制cxcr4信號通路后,在裸鼠胃癌原位移植瘤模型中的結(jié)果更具有說服力,胃癌細胞的局部侵襲能力受顯著抑制,同時肝臟轉(zhuǎn)移能力顯著受損。以上數(shù)據(jù)證實,cxcr4作為runx2下游一個極為重要的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮維持胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。總之,通過大樣本臨床組化檢測證實,RUNX2與多種臨床病理參數(shù)密切相關(guān),是胃癌患者的重要的預示因子。體內(nèi)外實驗證實,RUNX2通過直接轉(zhuǎn)錄激活CXCR4進而促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。通過抑制CXCR4信號通路活性可顯著降低胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移,顯著延長小鼠的生存時間。以上結(jié)果表明,RUNX2可作為臨床腫瘤診療的提示因子,為今后靶向RUNX2/CXCR4通路的藥物研發(fā)提供有價值的試驗數(shù)據(jù)和可行性依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;OB glue paste technique for establishing nude mouse human gastric cancer orthotopic transplantation models[J];World Journal of Gastroenterology;2008年30期

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本文編號：2400788