【摘要】：目的構建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表達慢病毒載體,并探討抑制miR-149表達對黑色素瘤Mel-RM細胞增殖及遷移的影響。方法由miRBase及NCBI數據庫查找獲得miR-149序列,設計合成其引物序列,通過退火反應獲得雙鏈DNA寡核苷酸片段,與載體p BS-h U6-1連接,將連接后的載體與FG12連接,經測序鑒定后獲得重組慢病毒載體;將重組慢病毒質粒分別與包裝輔助質粒共轉染至293T細胞中,包裝產生病毒,進行病毒滴度測定,再用包裝后的病毒感染Mel-RM細胞,利用實時熒光定量PCR法檢測miR-149表達水平。同時用MTT法及細胞遷移實驗分別檢測細胞增殖和遷移能力。結果成功構建了抑制miR-149表達的慢病毒載體,測序證實了所插入的基因序列正確。在熒光顯微鏡下觀察到轉染后的297T細胞表達大量綠色熒光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法測得的重組載體病毒滴度為3.2×1010TU/L。將病毒感染Mel-RM細胞顯示可有效降低miR-149的表達水平(P0.05)。MTT法結果顯示與感染空載FG12病毒的對照組相比,感染抑制miR-149表達重組質粒的實驗組中活細胞數明顯減少(P0.05)。細胞遷移實驗結果顯示與對照組相比實驗組明顯抑制了Mel-RM細胞的遷移(P0.001)。結論成功構建抑制miR-149表達的慢病毒載體,抑制miR-149的表達可以抑制Mel-RM細胞的增殖和遷移。并為后續(xù)進一步研究miR-149對黑色素瘤細胞發(fā)生發(fā)展的影響提供依據。
[Abstract]:Objective to construct a human microRNA149 (Hsa-miR-149) vector that inhibits the expression of lentivirus and to investigate the effect of inhibiting miR-149 expression on the proliferation and migration of melanoma Mel-RM cells. Methods the miR-149 sequence was obtained from miRBase and NCBI database, the primer sequence was designed and synthesized, the double-stranded DNA oligonucleotide fragment was obtained by annealing reaction, and ligated with the vector p BS-h U6-1. The ligated vector was connected with FG12. The recombinant lentivirus vector was obtained by sequencing. The recombinant lentivirus plasmids were cotransfected into 293T cells respectively with packaging assistant plasmids. The virus was packaged to produce the virus, then the virus titer was determined, and then the packaged virus was used to infect the Mel-RM cells. The expression of miR-149 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. At the same time, MTT assay and cell migration assay were used to detect cell proliferation and migration ability. Results Lentivirus vector was successfully constructed to inhibit the expression of miR-149, and the sequence of the inserted gene was confirmed by sequencing. A large amount of green fluorescent protein was expressed in 297T cells transfected with fluorescence microscope. The viral titer of the recombinant vector was 3.2 脳 10 ~ (10) TU / L measured by gradient titration. The expression level of miR-149 was significantly decreased by Mel-RM cells infected with virus (P0.05). MTT results showed that compared with the control group infected with non-loaded FG12 virus, the expression of miR-149 was significantly lower than that of the control group infected with non-loaded FG12 virus. The number of living cells in the experimental group infected with the recombinant plasmid expressing miR-149 was significantly decreased (P0.05). The results of cell migration assay showed that the migration of Mel-RM cells was significantly inhibited in the experimental group compared with the control group (P0. 001). Conclusion Lentivirus vector was successfully constructed to inhibit the expression of miR-149 and the expression of miR-149 could inhibit the proliferation and migration of Mel-RM cells. It provides the basis for further study on the effect of miR-149 on the development of melanoma cells.
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科;安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院科研部;
【基金】：國家自然科學基金(編號:81101525)
【分類號】：R739.5

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本文編號：2400000