發(fā)布時(shí)間：2018-12-30 22:30

【摘要】：無機(jī)砷(iAs)既可以引起機(jī)體癌變、心血管功能衰竭及神經(jīng)損傷,又可以治療癌癥,特別是三氧化二砷(As3+)成功應(yīng)用于治療急性早幼粒白血病(APL)之后,人們越來越關(guān)注iAs的生物功能和藥用價(jià)值。越來越多的研究表明,iAs的雙面生物學(xué)效應(yīng)與其在細(xì)胞內(nèi)的甲基化代謝密切相關(guān)�；诖�,本文從砷甲基化反應(yīng)機(jī)制、砷中毒解毒機(jī)制以及砷和硒治療APL的分子機(jī)制三個(gè)方面探究了砷代謝及其雙面生物學(xué)功能。我們應(yīng)用酶動力學(xué)、多種光譜和質(zhì)譜方法對砷甲基化代謝機(jī)制進(jìn)行了探究。同時(shí),我們以HepG2細(xì)胞為對象,研究了二巰基丙磺酸(DMPS)對砷在細(xì)胞內(nèi)甲基化代謝的影響并解釋了DMPS對砷中毒的解毒機(jī)制。隨后,我們用RT-PCR、western-blot等多種分子生物學(xué)方法探究了砷和硒對APL細(xì)胞凋亡和分化的影響以及相應(yīng)分子機(jī)制。主要工作如下：1.在體外克隆和表達(dá)得到人重組砷甲基化酶(hAS3MT),應(yīng)用快平衡動力學(xué)模型分析了As3+、甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)以及還原劑谷胱甘肽(GSH)與hAS3MT結(jié)合順序的問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AdoMet是第一個(gè)結(jié)合到hAS3MT上的底物；當(dāng)形成酶-AdoMet復(fù)合物之后,GSH與酶-AdoMet結(jié)合,As3+是最后結(jié)合到hAS3MT上的物種。在hAS3MT催化的MMA3+甲基化反應(yīng)中,AdoMet、GSH和MMA3+也依次與hAS3MT結(jié)合。同時(shí),我們應(yīng)用紫外-可見光(UV-vis)光譜,圓二色譜(CD),熒光光譜等多種方法探究了底物與hAS3MT之間的相互作用關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：AdoMet以疏水作用與hAS3MT結(jié)合并誘導(dǎo)酶構(gòu)象的改變；GSH對酶二級結(jié)構(gòu)的影響很大,其可顯著增加hAS3MT二級結(jié)構(gòu)中β-折疊成分；As3+與Cys61、Cys156和Cys206結(jié)合,該相互作用并沒有改變酶構(gòu)象。隨后我們用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)以及光譜學(xué)方法分析了hAS3MT上半胱氨酸殘基對As3+甲基化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hAS3MT中存在Cys368-Cys369和Cys250-Cys32兩對二硫鍵。其中,二硫鍵Cys250-Cys32在hAS3MT催化As3+甲基化反應(yīng)之前被GSH還原。Cys250參與甲基從AdoMet轉(zhuǎn)移到As3+的過程,并與生成的S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)以二硫鍵方式形成Cys250-AdoHcy中間產(chǎn)物。GSH還原該中間產(chǎn)物,在釋放AdoHcy的同時(shí)恢復(fù)Cys250的活性。Cys156和Cys206通過形成分子內(nèi)二硫鍵的方式促進(jìn)甲基化產(chǎn)物從酶上釋放。等到相應(yīng)甲基化反應(yīng)結(jié)束之后,二硫鍵Cys156-Cys206被GSH還原并參與到下一輪的催化循環(huán)中。2.以HepG2細(xì)胞為研究對象,探究了DMPS對As3+中毒的解毒機(jī)制。應(yīng)用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)分析了細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞培養(yǎng)基中砷的形態(tài)和含量。同時(shí),應(yīng)用RT-PCR和western-blot探究了DMPS對HepG2細(xì)胞內(nèi)hAS3MT表達(dá)的影響。隨后,用流式細(xì)胞儀分析了DMPS對As3+引起的活性氧物種(ROS)的累積及細(xì)胞凋亡的影響。最后,用動力學(xué)手段分析了DMPS對]hAS3MT催化的As3+/MMA3+甲基化反應(yīng)的抑制機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DMPS從三個(gè)方面來減輕由As3+引起的生物毒性：(1)DMPS抑制細(xì)胞吸收As3+并促進(jìn)細(xì)胞排泄As3+及其甲基化代謝產(chǎn)物；(2)DMPS可以清除細(xì)胞內(nèi)由As3+引起的ROS累積,繼而降低其對細(xì)胞的氧化損傷；(3)DMPS抑制細(xì)胞內(nèi)As3+的甲基化代謝：一方面,DMPS抑制細(xì)胞內(nèi)hAS3MT的表達(dá)；另一方面,DMPS與As3+/MMA3+競爭性結(jié)合,阻斷As3+/MMA3+參與相應(yīng)的甲基化反應(yīng)。3.應(yīng)用RT-PCR以及western-blot等多種分子生物學(xué)方法探究了As3+,As4S4以及亞硒酸(Se4+)對APL細(xì)胞凋亡和分化的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,As4S4和Se4+與As3+相似,它們會因劑量的不同分別誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡和分化。其中,As4S4引起的細(xì)胞凋亡和分化機(jī)制與As3+引起的分化和凋亡機(jī)制相似：當(dāng)As4S4在低濃度范圍(0.1-0.4μM)時(shí),通過降解白血病蛋白-維甲酸受體α(PML-RARα)融合蛋白來誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化；當(dāng)As4S4在高濃度范圍(0.5-2.0μM)時(shí),誘導(dǎo)相應(yīng)的細(xì)胞通過與ROS相關(guān)的多種通路凋亡。然而,較低濃度的Se4+則不同：1.0-2.0 gM的Se4+并不會引起APL細(xì)胞的凋亡和分化；2.0-4.0μM的Se4+同時(shí)誘導(dǎo)APL細(xì)胞的凋亡和分化。同樣地,Se4+(2.0-4.0μM)通過降解PML-RARα融合蛋白來誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞分化；然而,該濃度范圍內(nèi)Se4+并不會引起細(xì)胞內(nèi)ROS的累積,它主要通過抑制核因子-κB(NFκB)信號通路來誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡。As3+和Se4+(2.0-4.0μM)聯(lián)用不但可以促進(jìn)APL細(xì)胞的凋亡和分化,還能降低細(xì)胞內(nèi)由As3+引起的ROS累積。這說明,二者協(xié)同可以更好地治療APL。
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【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 姜國勝,畢可紅,唐天華,張玉昆,任海全,姜楓勤,任青華,真剛,劉傳芳,彭軍,郭桂月,劉秀蘭,田志剛;Effect of arsenic trioxide on cytokine expression by acute promyelocytic leukemia cells[J];Chinese Medical Journal;2003年11期

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本文編號：2396256