【摘要】：結(jié)腸直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，，miRNA在該疾病的發(fā)生和發(fā)展中都具有作用。據(jù)報(bào)道，miRNA能夠識(shí)別靶基因mRNA的3’UTR，抑制蛋白翻譯，從而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)及參與生物體生命活動(dòng)中。在結(jié)腸直腸癌治療中，藥物的耐藥性是阻礙治療的重要影響因素，其中miRNA也參與到藥物的敏感性機(jī)制中。本實(shí)驗(yàn)的研究目的即是檢測(cè)miR-378在結(jié)腸直腸癌中的生物學(xué)功能。 本實(shí)驗(yàn)主要從四部分驗(yàn)證miR-378在結(jié)腸直腸癌發(fā)生發(fā)展及治療中的作用。一：檢測(cè)miR-378在結(jié)腸直腸癌組織、細(xì)胞系、血清中的表達(dá)及臨床意義，并檢測(cè)miR-378在細(xì)胞系內(nèi)的相關(guān)生物功能。二：通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-378下游靶基因，并鑒定miR-378通過識(shí)別靶基因調(diào)節(jié)相關(guān)的生物學(xué)通路。三：我們還研究了miR-378在L-OHP誘導(dǎo)的結(jié)腸直腸癌凋亡中的作用。四：應(yīng)用裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-378的生物學(xué)功能。 方法：一：利用定量PCR的方法檢測(cè)20對(duì)結(jié)腸直腸患者癌組織及癌旁組織miR-378的表達(dá)；檢測(cè)6種癌細(xì)胞系HCT116、HT29、DLD-1、LOVO、SW620、SW480和兩種正常結(jié)腸直腸上皮細(xì)胞系FHC、NCM460中miR-378的表達(dá)；檢測(cè)51例患者血清內(nèi)miR-378的表達(dá)，并分析其與結(jié)腸直腸癌患者生存曲線的關(guān)系。在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系HCT116及HT29中，轉(zhuǎn)染miR-378mimics及mimicscontrol，提高細(xì)胞內(nèi)miR-378的表達(dá)水平。在通過克隆形成、MTT活性檢測(cè)、PI染色流式檢測(cè)周期實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞過表達(dá)miR-378后對(duì)增殖、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期及凋亡的影響。二：通過生物學(xué)信息查找miR-378識(shí)別的靶基因。通過定量PCR及western blotting檢測(cè)過表達(dá)miR-378后，CDC40mRNA及蛋白的表達(dá)。通過質(zhì)粒構(gòu)建方法將CDC40mRNA的3’UTR野生型及突變性序列構(gòu)建到熒光報(bào)告基因載體上。在HCT116和HT29細(xì)胞內(nèi)分別共轉(zhuǎn)CDC3’UTR wt+mimicscontrol、CDC3’UTR wt+miR-378mimics、CDC3’UTR mut+mimics control，和CDC3’UTR mut+miR-378mimics,檢測(cè)miR-378對(duì)于CDC403’UTR序列的識(shí)別作用。在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT116和HT29內(nèi)轉(zhuǎn)染si-control和CDC40siRNA-1/2,抑制CDC40的表達(dá)。在通過MTT活性檢測(cè)、克隆形成、PI染色流式檢測(cè)周期實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞敲減CDC40后對(duì)增殖、生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞周期的影響。在細(xì)胞HCT116及HT29內(nèi)分別轉(zhuǎn)染mimics control，pCMV6vector+miR-378mimics、pCMV6/CDC40+miR-378mimics，用過表達(dá)PARK7的方法恢復(fù)miR-378所造成的CDC40的降低。在通過MTT活性檢測(cè)、克隆形成及PI染色流式檢測(cè)周期實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞恢復(fù)CDC40表達(dá)后對(duì)增殖及細(xì)胞周期的影響。定量PCR及免疫組化檢測(cè)20例結(jié)腸直腸癌組織及癌旁組織內(nèi)miR-378的mRNA及蛋白的表達(dá)。三：在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT116及HT29中，分別過表達(dá)miR-378后，利用Annexin-V/7-AAD染色及細(xì)胞流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率。在HCT116及HT29內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNAcontrol及miRNAmimics后，利用不同濃度的L-OHP處理，MTT檢測(cè)細(xì)胞的活性。利用同一濃度的L-OHP處理轉(zhuǎn)染后的HCT116及HT29，Annexin-V/7-AAD染色及細(xì)胞流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。四：利用HCT116細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-control和miR-378mimics，過表達(dá)miR-378。等足夠數(shù)量的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，獲取并融在適量的濃度。在裸鼠右肩部注射100uL，在第6天開始檢測(cè)腫瘤長(zhǎng)度和寬度，27天后剝瘤稱量。 結(jié)果： 一:miR-378在人類結(jié)腸直腸癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義 在20對(duì)結(jié)腸直腸癌組織及癌旁組織中，90%的癌組織內(nèi)miR-378表達(dá)呈顯著降低（P＜0.01）。在6種結(jié)腸直腸癌細(xì)胞內(nèi)，miR-378相比于正常結(jié)腸直腸上皮細(xì)胞也呈現(xiàn)低表達(dá)，并具有均差異顯著性（P＜0.05）。在原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性患者血清中，miR-378表達(dá)水平分別為2.63±1.13、2.87±1.08，與正常志愿者血清中表達(dá)水平相比顯著升高（P＞0.05）。Kaplan Meier生存曲線結(jié)果顯示miR-378表達(dá)與患者生存期無顯著相關(guān)性（P0.05）。克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期檢測(cè)過表達(dá)miR-378抑制HCT116及HT29細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制周期的進(jìn)行（P＜0.05）。 二：miR-378通過CDC40調(diào)節(jié)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及周期 在PicTar和TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中，miR-378均能夠和CDC40mRNA的3’UTR互補(bǔ)配對(duì)。通過熒光素酶報(bào)告分析檢測(cè)可知，miR-378能夠識(shí)別CDC40mRNA的3’UTR，抑制熒光素酶的活性（P＜0.05）。在HCT116及HT29內(nèi)，過表達(dá)miR-378能夠抑制CDC40蛋白和mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。CDC40siRNA-1/2降低了細(xì)胞內(nèi)CDC40的mRNA和蛋白的表達(dá)（P＜0.05），克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示敲減CDC40后，抑制細(xì)胞克隆的形成及阻抑細(xì)胞周期的進(jìn)行。在恢復(fù)實(shí)驗(yàn)中，通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)CDC40質(zhì)粒過表達(dá)CDC40，恢復(fù)了過表達(dá)miR-378造成的CDC40的降低，并且克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示恢復(fù)了細(xì)胞克隆形成的能力。定量PCR檢測(cè)20例結(jié)腸直腸癌患者癌組織內(nèi)CDC40高表達(dá)，相較于癌旁組織。CDC40的表達(dá)與miR-378的表達(dá)呈反相關(guān)（R=-0.710,P=0.0005）。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，CDC40表達(dá)在癌組織中顯著高于癌旁正常組織。 三：過表達(dá)miR-378提高L-OHP誘導(dǎo)的凋亡 在細(xì)胞HCT116及HT29內(nèi)，過表達(dá)miR-378對(duì)細(xì)胞凋亡的無顯著影響。利用不同濃度的L-OHP處理，過表達(dá)miR-378降低了L-OHP對(duì)細(xì)胞的半致死劑量（P＜0.05）。4μM L-OHP處理過表達(dá)miR-378的HCT116及HT29，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-378后顯著提高L-OHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。原位末端標(biāo)記法同樣顯示過表達(dá)miR-378促進(jìn)L-OHP誘導(dǎo)向細(xì)胞凋亡。 四：體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-378對(duì)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 接種細(xì)胞后每隔2天檢測(cè)一次腫瘤的長(zhǎng)度和寬度，隨著接種時(shí)間的增加，過表達(dá)miR-378的腫瘤生長(zhǎng)的速度明顯慢于對(duì)照組，差異具有顯著性（P＜0.05）。在27天剝瘤后，過表達(dá)miR-544的腫瘤的重量顯著少于對(duì)照組，差異具有顯著性（P＜0.01）。 結(jié)論： (1): miR-378在結(jié)腸直腸癌組織內(nèi)及癌細(xì)胞系內(nèi)均低表達(dá)，在結(jié)直腸患者血清高表達(dá)，血清miR-378表達(dá)水平與患者生存曲線無顯著相關(guān)性。 (2):體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MiR-378能夠抑制細(xì)胞增值。 (3)：miR-378通過靶向結(jié)合CDC40調(diào)控細(xì)胞增殖。 (4):過表達(dá)miR-378能夠提高L-OHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 崔龍;遺傳性非息肉病性大腸癌的診治進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)用外科雜志;2005年03期

本文編號(hào)：2388107