【摘要】：結(jié)腸直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，，miRNA在該疾病的發(fā)生和發(fā)展中都具有作用。據(jù)報道，miRNA能夠識別靶基因mRNA的3’UTR，抑制蛋白翻譯，從而調(diào)節(jié)目的基因的表達及參與生物體生命活動中。在結(jié)腸直腸癌治療中，藥物的耐藥性是阻礙治療的重要影響因素，其中miRNA也參與到藥物的敏感性機制中。本實驗的研究目的即是檢測miR-378在結(jié)腸直腸癌中的生物學功能。 本實驗主要從四部分驗證miR-378在結(jié)腸直腸癌發(fā)生發(fā)展及治療中的作用。一：檢測miR-378在結(jié)腸直腸癌組織、細胞系、血清中的表達及臨床意義，并檢測miR-378在細胞系內(nèi)的相關生物功能。二：通過生物信息學預測miR-378下游靶基因，并鑒定miR-378通過識別靶基因調(diào)節(jié)相關的生物學通路。三：我們還研究了miR-378在L-OHP誘導的結(jié)腸直腸癌凋亡中的作用。四：應用裸鼠移植瘤實驗驗證miR-378的生物學功能。 方法：一：利用定量PCR的方法檢測20對結(jié)腸直腸患者癌組織及癌旁組織miR-378的表達；檢測6種癌細胞系HCT116、HT29、DLD-1、LOVO、SW620、SW480和兩種正常結(jié)腸直腸上皮細胞系FHC、NCM460中miR-378的表達；檢測51例患者血清內(nèi)miR-378的表達，并分析其與結(jié)腸直腸癌患者生存曲線的關系。在結(jié)腸直腸癌細胞系HCT116及HT29中，轉(zhuǎn)染miR-378mimics及mimicscontrol，提高細胞內(nèi)miR-378的表達水平。在通過克隆形成、MTT活性檢測、PI染色流式檢測周期實驗來檢測細胞過表達miR-378后對增殖、生長曲線、細胞周期及凋亡的影響。二：通過生物學信息查找miR-378識別的靶基因。通過定量PCR及western blotting檢測過表達miR-378后，CDC40mRNA及蛋白的表達。通過質(zhì)粒構(gòu)建方法將CDC40mRNA的3’UTR野生型及突變性序列構(gòu)建到熒光報告基因載體上。在HCT116和HT29細胞內(nèi)分別共轉(zhuǎn)CDC3’UTR wt+mimicscontrol、CDC3’UTR wt+miR-378mimics、CDC3’UTR mut+mimics control，和CDC3’UTR mut+miR-378mimics,檢測miR-378對于CDC403’UTR序列的識別作用。在結(jié)腸直腸癌細胞HCT116和HT29內(nèi)轉(zhuǎn)染si-control和CDC40siRNA-1/2,抑制CDC40的表達。在通過MTT活性檢測、克隆形成、PI染色流式檢測周期實驗來檢測細胞敲減CDC40后對增殖、生長曲線及細胞周期的影響。在細胞HCT116及HT29內(nèi)分別轉(zhuǎn)染mimics control，pCMV6vector+miR-378mimics、pCMV6/CDC40+miR-378mimics，用過表達PARK7的方法恢復miR-378所造成的CDC40的降低。在通過MTT活性檢測、克隆形成及PI染色流式檢測周期實驗來檢測細胞恢復CDC40表達后對增殖及細胞周期的影響。定量PCR及免疫組化檢測20例結(jié)腸直腸癌組織及癌旁組織內(nèi)miR-378的mRNA及蛋白的表達。三：在結(jié)腸直腸癌細胞HCT116及HT29中，分別過表達miR-378后，利用Annexin-V/7-AAD染色及細胞流式檢測細胞凋亡比率。在HCT116及HT29內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNAcontrol及miRNAmimics后，利用不同濃度的L-OHP處理，MTT檢測細胞的活性。利用同一濃度的L-OHP處理轉(zhuǎn)染后的HCT116及HT29，Annexin-V/7-AAD染色及細胞流式檢測細胞凋亡變化。四：利用HCT116細胞，分別轉(zhuǎn)染miR-control和miR-378mimics，過表達miR-378。等足夠數(shù)量的細胞處于對數(shù)生長期，獲取并融在適量的濃度。在裸鼠右肩部注射100uL，在第6天開始檢測腫瘤長度和寬度，27天后剝瘤稱量。 結(jié)果： 一:miR-378在人類結(jié)腸直腸癌中的表達及生物學意義 在20對結(jié)腸直腸癌組織及癌旁組織中，90%的癌組織內(nèi)miR-378表達呈顯著降低（P＜0.01）。在6種結(jié)腸直腸癌細胞內(nèi)，miR-378相比于正常結(jié)腸直腸上皮細胞也呈現(xiàn)低表達，并具有均差異顯著性（P＜0.05）。在原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性患者血清中，miR-378表達水平分別為2.63±1.13、2.87±1.08，與正常志愿者血清中表達水平相比顯著升高（P＞0.05）。Kaplan Meier生存曲線結(jié)果顯示miR-378表達與患者生存期無顯著相關性（P0.05）。克隆形成實驗及細胞周期檢測過表達miR-378抑制HCT116及HT29細胞的生長，抑制周期的進行（P＜0.05）。 二：miR-378通過CDC40調(diào)節(jié)結(jié)腸直腸癌細胞的生長及周期 在PicTar和TargetScan數(shù)據(jù)庫中，miR-378均能夠和CDC40mRNA的3’UTR互補配對。通過熒光素酶報告分析檢測可知，miR-378能夠識別CDC40mRNA的3’UTR，抑制熒光素酶的活性（P＜0.05）。在HCT116及HT29內(nèi)，過表達miR-378能夠抑制CDC40蛋白和mRNA的表達（P＜0.05）。CDC40siRNA-1/2降低了細胞內(nèi)CDC40的mRNA和蛋白的表達（P＜0.05），克隆形成實驗及流式檢測細胞周期結(jié)果顯示敲減CDC40后，抑制細胞克隆的形成及阻抑細胞周期的進行。在恢復實驗中，通過轉(zhuǎn)染過表達CDC40質(zhì)粒過表達CDC40，恢復了過表達miR-378造成的CDC40的降低，并且克隆形成實驗顯示恢復了細胞克隆形成的能力。定量PCR檢測20例結(jié)腸直腸癌患者癌組織內(nèi)CDC40高表達，相較于癌旁組織。CDC40的表達與miR-378的表達呈反相關（R=-0.710,P=0.0005）。免疫組化檢測結(jié)果顯示，CDC40表達在癌組織中顯著高于癌旁正常組織。 三：過表達miR-378提高L-OHP誘導的凋亡 在細胞HCT116及HT29內(nèi)，過表達miR-378對細胞凋亡的無顯著影響。利用不同濃度的L-OHP處理，過表達miR-378降低了L-OHP對細胞的半致死劑量（P＜0.05）。4μM L-OHP處理過表達miR-378的HCT116及HT29，結(jié)果顯示過表達miR-378后顯著提高L-OHP誘導的細胞凋亡（P＜0.05）。原位末端標記法同樣顯示過表達miR-378促進L-OHP誘導向細胞凋亡。 四：體內(nèi)動物實驗驗證miR-378對結(jié)腸直腸癌細胞生長的影響 接種細胞后每隔2天檢測一次腫瘤的長度和寬度，隨著接種時間的增加，過表達miR-378的腫瘤生長的速度明顯慢于對照組，差異具有顯著性（P＜0.05）。在27天剝瘤后，過表達miR-544的腫瘤的重量顯著少于對照組，差異具有顯著性（P＜0.01）。 結(jié)論： (1): miR-378在結(jié)腸直腸癌組織內(nèi)及癌細胞系內(nèi)均低表達，在結(jié)直腸患者血清高表達，血清miR-378表達水平與患者生存曲線無顯著相關性。 (2):體內(nèi)及體外實驗驗證MiR-378能夠抑制細胞增值。 (3)：miR-378通過靶向結(jié)合CDC40調(diào)控細胞增殖。 (4):過表達miR-378能夠提高L-OHP誘導的細胞凋亡。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.3

【參考文獻】

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1 崔龍;遺傳性非息肉病性大腸癌的診治進展[J];中國實用外科雜志;2005年03期

本文編號：2388107