【摘要】：背景:肺癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率均居首位,5年生存率約為15%。目前治療的主要手段仍然是化療,盡管化療方案大多采用不同作用機(jī)制藥物的聯(lián)合治療,但由于肺癌細(xì)胞容易產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性,常常會(huì)導(dǎo)致化療失敗。腫瘤的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜。腫瘤細(xì)胞生存通路PI3K-AKT表達(dá)上調(diào)是引起肺癌耐藥的一個(gè)重要因素。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞PI3K-AKT表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。然而,目前臨床上單一應(yīng)用這些通路相關(guān)蛋白抑制劑療效差或無持續(xù)療效,提示聯(lián)合多種不同作用靶向藥物或進(jìn)一步尋找通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)都有可能治療腫瘤。腫瘤微環(huán)境在以下情況可產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,如缺氧、低糖、酸中毒等。持久的應(yīng)激可以誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),使細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)表達(dá)增多。GRP78參與多種腫瘤的耐藥并成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。有研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路參與了UPR調(diào)控,盡管在其激活或者抑制UPR的調(diào)控結(jié)果上存在爭議。另外,抑制PI3K的激活已被證明能下調(diào)肝細(xì)胞癌GRP78表達(dá),提示促生存通路可調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)。但是,在肺癌細(xì)胞,PI3K-AKT通路的激活是否參與GRP78表達(dá)尚無研究。研究腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞和其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化要求構(gòu)建一個(gè)能模擬體內(nèi)微環(huán)境的多細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)模式。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法不僅步驟復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長,消耗材料較多,靈敏度也欠佳;而基于微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái),不僅克服了傳統(tǒng)方法的上述缺點(diǎn),還具有高通量、集成化、快速檢測和消耗試劑少等優(yōu)勢。由于微流控芯片各組件的大小依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)及生長所需的空間設(shè)計(jì),因此二者可相互匹配,有利于操縱和分析細(xì)胞;而且,芯片微通道的多維空間及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)封閉,這又與生理狀態(tài)下細(xì)胞生存的空間環(huán)境特征相接近,以上特點(diǎn)決定了微流控芯片在三維細(xì)胞培養(yǎng)方面有很大優(yōu)勢。因此,在本研究中我們利用微流控芯片這一新興的技術(shù)平臺(tái),進(jìn)行腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞化療耐藥機(jī)制研究:以非直接接觸的方式共培養(yǎng)肺癌細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞,并觀察肺癌a549細(xì)胞pi3k-akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和grp78蛋白表達(dá)的變化,探索間質(zhì)細(xì)胞參與腫瘤化療耐藥性研究,以期為肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)以及為聯(lián)合治療方案的設(shè)計(jì)提供幫助。研究內(nèi)容:1、三維微流控芯片細(xì)胞共培養(yǎng)檢測平臺(tái)的設(shè)計(jì)與制作。依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞之間、細(xì)胞與藥物之間、細(xì)胞與培養(yǎng)介質(zhì)之間相互作用的特性,結(jié)合流體力學(xué)原理以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的平行對(duì)照原則,設(shè)計(jì)并制作了一個(gè)雙層、多單元集成、多通道連接的高通量微流控芯片實(shí)驗(yàn)室,以滿足聯(lián)合三維細(xì)胞培養(yǎng)和藥敏檢測的需要。用pdms作為芯片材料,首先制作上游二維細(xì)胞培養(yǎng)池,并篩選出最有利于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的芯片條件,構(gòu)建成纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系。然后制作下游三維培養(yǎng)池,篩選出最有利于肺癌a549細(xì)胞培養(yǎng)和生長的微環(huán)境,構(gòu)建下游三維細(xì)胞培養(yǎng)體系。上游二維培養(yǎng)池和下游三維培養(yǎng)池之間有多條微通道相連接,保證上游成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能夠隨著流動(dòng)的培養(yǎng)基向下游區(qū)域連續(xù)供給,使下游三維培養(yǎng)池內(nèi)的細(xì)胞連續(xù)受到上游分泌的細(xì)胞因子的影響,以非直接接觸模式進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)。2、基于微流控芯片平臺(tái)研究caf介導(dǎo)的a549細(xì)胞pi3k-akt表達(dá)和耐藥相關(guān)性分析。把a(bǔ)549肺癌細(xì)胞上清液加入培養(yǎng)基以誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞hfl-1,檢測成纖維細(xì)胞經(jīng)肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)后α-sma蛋白的表達(dá)。將激活的hfl-1細(xì)胞(癌相關(guān)成纖維細(xì)胞/caf)置于上游二維芯片培養(yǎng),a549細(xì)胞在下游三維芯片培養(yǎng)。在顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞在不同培養(yǎng)模式下的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),按平行對(duì)照原則,進(jìn)行細(xì)胞分組培養(yǎng)及藥物干預(yù)。采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法檢測a549細(xì)胞pi3k-akt蛋白的表達(dá),采用hoechst33342、pi雙染色法確定肺癌細(xì)胞在paclitaxel藥物作用下的生存率。通過研究耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞在化療藥物干預(yù)作用下的生存率,分析促生存通路蛋白在肺癌細(xì)胞對(duì)paclitaxel化療耐藥中的作用。3、基于微流控平臺(tái)a549細(xì)胞grp78蛋白表達(dá)及與pi3k-akt通路激活相關(guān)性研究。在三維細(xì)胞培養(yǎng)體系中,采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法檢測a549肺癌細(xì)胞grp78蛋白的表達(dá)。在加入pi3k-akt通路蛋白抑制劑分組藥物干預(yù)后,采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法檢測a549細(xì)胞grp78蛋白的表達(dá)。hoechst33342、pi雙染色法確定肺癌細(xì)胞在paclitaxel及/或通路蛋白抑制劑、grp78抑制劑等藥物作用下的生存率,明確成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的促生存通路及urp通路表達(dá)在促進(jìn)肺癌細(xì)胞生存及耐藥中的作用。4、基于微流控平臺(tái)的細(xì)胞因子檢測。將激活的肺成纖維細(xì)胞hfl1置于二維細(xì)胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)6小時(shí),在培養(yǎng)液出口處收集不同時(shí)間點(diǎn)的上清液,采用elisa的方法檢測上清液中分泌的細(xì)胞生長因子(hgf)水平。通過芯片平臺(tái),檢測肺癌a549細(xì)胞met磷酸化水平及pi3k-akt表達(dá)變化。應(yīng)用外源性hgf純品作用于肺癌a549細(xì)胞后,觀察上述指標(biāo),以檢驗(yàn)成纖維細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的影響可能是由hgf介導(dǎo)的。結(jié)果:1、微流控芯片細(xì)胞共培養(yǎng)檢測平臺(tái)的構(gòu)建。依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞之間、細(xì)胞與藥物之間、細(xì)胞與培養(yǎng)介質(zhì)之間相互作用的特性,結(jié)合流體力學(xué)原理以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的平行對(duì)照原則,設(shè)計(jì)并制作了一個(gè)雙層、多單元集成、多通道連接的高通量微流控芯片實(shí)驗(yàn)室,以滿足聯(lián)合三維細(xì)胞培養(yǎng)和藥敏檢測的需要。①在上層芯片上設(shè)計(jì)4個(gè)適合hfl-1細(xì)胞生長的平行的細(xì)胞培養(yǎng)池,使細(xì)胞能夠貼壁生長,產(chǎn)生的細(xì)胞因子可隨流動(dòng)介質(zhì)注入下層培養(yǎng)池。②下層芯片包括4個(gè)平行的檢測單元,每個(gè)檢測單元包括三維的a549細(xì)胞培養(yǎng)池和其上游濃度發(fā)生器。細(xì)胞培養(yǎng)池灌注方式為培養(yǎng)基側(cè)流,共同的濃度發(fā)生器可以生成四個(gè)特定的濃度,頂端液池為加藥池。在實(shí)際操作中,可以加入與藥物分子量相近的熒光分子進(jìn)行表征,通過測定不同培養(yǎng)池中的熒光強(qiáng)度值,可以得到實(shí)際的濃度比。③上下層芯片之間微通道的設(shè)計(jì),能夠允許hfl-1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及培養(yǎng)基通過,激活的hfl-1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以滲透入三維基質(zhì)膠里作用于a549細(xì)胞。結(jié)果表明:微流控芯片可通過非直接接觸的細(xì)胞共培養(yǎng),有效地分析癌相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌液對(duì)肺癌細(xì)胞促生存的作用。該微流控芯片體系通過注射泵驅(qū)動(dòng)芯片通道內(nèi)液體的流動(dòng),使細(xì)胞培養(yǎng)始終處于流動(dòng)介質(zhì)環(huán)境中。和傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)相比,該體系可以模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件下血液的流動(dòng)及對(duì)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng),更接近體內(nèi)的動(dòng)態(tài)微環(huán)境。2、微流控芯片三維共培養(yǎng)的a549細(xì)胞活力增強(qiáng)與pi3k-akt上調(diào)有關(guān)。免疫熒光結(jié)果顯示:在加入肺癌a549細(xì)胞上清液的培養(yǎng)基中,hfl-1表達(dá)α-sma顯著增高,后者是成纖維細(xì)胞激活(癌相關(guān)成纖維細(xì)胞/caf)的主要標(biāo)志。在芯片動(dòng)態(tài)流動(dòng)介質(zhì)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示,上游的激活的hfl-1細(xì)胞均有良好貼壁,生長狀態(tài)較好。下游的a549細(xì)胞在基質(zhì)膠里生長狀態(tài)好,伸展正常。在化療藥物paclitaxel作用下,共培養(yǎng)的a549細(xì)胞細(xì)胞凋亡率降低。三維培養(yǎng)的a549細(xì)胞檢測中,免疫熒光結(jié)果顯示在激活的hfl-1細(xì)胞的誘導(dǎo)下,a549細(xì)胞pi3k、akt的表達(dá)均顯著增高。應(yīng)用pi3k/akt抑制劑能明顯增加a549細(xì)胞凋亡,提示促生存通路的激活與腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)。3、grp78介導(dǎo)的a549細(xì)胞耐藥與上調(diào)的pi3k-akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。免疫熒光結(jié)果顯示在激活的hfl-1細(xì)胞的誘導(dǎo)下,a549細(xì)胞pi3k、akt、grp78的表達(dá)均顯著增高。應(yīng)用pi3k/akt抑制劑導(dǎo)致grp78表達(dá)降低。相反,應(yīng)用grp78抑制劑對(duì)pi3k/akt表達(dá)無影響,提示grp78可能位于pi3k/akt下游。grp78功能抑制劑可促進(jìn)a549細(xì)胞凋亡,提示共培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)的grp78升高,通過抑制a549細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞耐藥。pi3k/akt抑制劑與grp78抑制劑有協(xié)同作用。4、caf介導(dǎo)的肺癌a549細(xì)胞grp78表達(dá)上調(diào)依賴于hgf/met途徑。成纖維細(xì)胞株hfl-1細(xì)胞(caf)分泌hgf因子明顯增多。應(yīng)用外源性hgf因子純品作用于三維培養(yǎng)的a549細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)met、pi3k、akt和grp78的表達(dá)明顯增高。met抑制劑可以抑制pi3k、akt的表達(dá),表明caf對(duì)a549細(xì)胞生存通路PI3K-AKT的影響可能是由HGF介導(dǎo)的。Met抑制劑和PI3K/AKT抑制劑均可使GRP78的表達(dá)有明顯降低。應(yīng)用Met抑制劑和PI3K/AKT抑制劑均增加A549細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步提示促生存通路的激活與腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)有關(guān)。結(jié)論:1、雙層、多單元集成、多通道高通量微流控梯度芯片實(shí)驗(yàn)室可以進(jìn)行近體內(nèi)生理環(huán)境條件下的腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)、藥物刺激、內(nèi)含物及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析,可用于腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥研究。2、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞可引起A549細(xì)胞促生存通路PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致A549細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥。3、GRP78位于PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游,提示促生存通路與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路存在交聯(lián)。PI3K/AKT抑制劑與GRP78抑制劑有協(xié)同促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡作用。4、激活的HFL-1細(xì)胞通過分泌HGF促使PI3K-AKT信號(hào)通路上調(diào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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8 李紹前;面向雙顆粒捕捉的介電電泳微流控芯片研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2012年

9 任玉敏;微流控芯片技術(shù)在電泳及微球制備中的研究和應(yīng)用[D];青島大學(xué);2013年

10 王艷;層粘連蛋白/巖藻聚糖類基膜微環(huán)境的構(gòu)建及微流控芯片內(nèi)應(yīng)用[D];西南交通大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：2387408