【摘要】：背景：肝癌(liver cancer)是全球第二大癌癥死因,全球大約50%肝癌患者在中國,其中肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)最為常見,這嚴重危害了人民群眾的健康。流行病學及已有的研究資料表明,乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染、黃曲霉素和酒精等與肝細胞肝癌的發(fā)病相關。隨著分子生物學研究的進展,肝癌發(fā)生發(fā)展的機制被進一步認識。目前普遍認為肝癌的發(fā)生是包括原癌基因激活和抑癌基因失活在內(nèi)的多步驟多階段的過程。研究肝癌發(fā)病的分子機制,發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點,對進一步預防和治療肝癌具有重要的意義。目前的基因組學研究確定了一些肝細胞肝癌中頻繁突變的基因,2012年在Nature Genetics先后有3篇文章報道了肝細胞肝癌的基因組測序結果,發(fā)現(xiàn)肝癌標本中CTNNB1、AXIN1、P53以及ARID1A有較高的突變率。關于CTNNB1、AXIN1、P53及相關通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用已有較多研究。但是,ARID1A在肝癌發(fā)生中的作用和機制尚不清楚,亟待進一步研究。目的：本課題旨在研究ARID1A基因失活性突變(inactivation)在肝癌發(fā)生中的作用。在不同的動物模型中,敲除Arid1a,觀察是否能導致或者加速肝癌的發(fā)生。在此基礎上,通過體內(nèi)外實驗,探索ARID1A失活性突變加速肝癌發(fā)生的可能機制。方法：1.構建用于敲除ARID1A的CRISPR-Cas9系統(tǒng)。2. 以C57BL/6J小鼠為對象,通過尾靜脈高壓注射將帶有靶向敲除Arid1a的sgRNA的CRISPR-Cas9質粒注射入肝臟,在正常小鼠肝臟中敲除Arid1a,研究Arid1a突變是否能直接導致肝癌的發(fā)生。3. 以C57BL/6J小鼠為對象,利用CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)和尾靜脈高壓注射技術,在正常小鼠肝臟中聯(lián)合敲除Arid1a、Pten、P53三個基因,和敲除Pten.P53的肝癌模型比較,研究Arid1a突變對肝臟腫瘤產(chǎn)生的影響。4.在DEN誘導小鼠肝癌模型中,利用CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)和尾靜脈高壓注射技術,敲除Arid1a,和對照的DEN肝癌模型組比較,研究Arid1a突變在這種動物模型中對腫瘤產(chǎn)生的影響。5.在人肝癌細胞系Be17404中運用CRISPR-Cas9技術,敲除ARID1A,獲得ARID1AKO的細胞系,通過RNAseq比較基因轉錄組差異。6.通過CCK-8細胞活力實驗和裸鼠皮下成瘤實驗,比較ARID1A KO細胞系和野生型的Be17404細胞系在細胞增殖方面的差異。7.用免疫組織化學染色法,檢測ARID1A在臨床肝癌病人標本中的表達,區(qū)分ARID1A陽性和陰性的病人,通過Kaplan-Meier生存曲線比較總生存率和無瘤生存率。8.運用共聚焦熒光顯微鏡觀察ARID1A KO的細胞,探索ARID1A缺失對細胞有絲分裂的影響。9.用細胞周期阻斷藥物MG132、Nocodazole處理野生型Be17404細胞系,分析細胞周期不同階段(M期、G2期)ARID1A表達量的差異。10.流式細胞分析比較ARID1A KO細胞系和野生型Be17404細胞系的細胞體倍數(shù)以及同步化釋放后細胞周期的差異。11.對ARID1A KO的肝癌細胞系進行IR、UV、順鉑處理,Western blot檢測r-H2A.X的變化,探索ARID1A缺失對細胞DNA損傷修復過程的影響。12.在體內(nèi)外用IR照射野生型Be17404和ARID1A KO細胞系,Western blot檢測Cleaved-PARP,免疫組織化學染色Cleaved-Caspase-3,比比較細胞對IR誘導的凋亡的反應。結果：1.在體內(nèi)外CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以靶向性的敲除目的基因。2.在成年的C57BL/6J小鼠肝臟中單獨敲除Arid1a,長期觀察未見腫瘤發(fā)生,但有更多P-Histone-H3染色陽性的肝細胞,有更多r-H2A.X染色陽性的肝細胞。3.在成年的C57BL/6J小鼠肝臟中聯(lián)合敲除Arid1a、Pten、P53三個基因,和敲除Pten、P53的小鼠比較,腫瘤更快發(fā)生,3個月肝臟表面可見異常結節(jié)。4.在DEN誘導的肝癌模型中,敲除Arid1a和對照的DEN模型組比較,腫瘤更快發(fā)生,6個月肝臟表面可見小腫瘤。5.運用CRISPR-Cas9技術,成功構建ARID1A KO的Be17404細胞系。通過Western blot、TA克隆測序、細胞免疫熒光、裸鼠皮下成瘤后的組織石蠟切片免疫組化染色確證。6.體外CCK-8實驗、裸鼠皮下成瘤實驗,均提示ARID1A KO和野生型的Be17404細胞系增殖能力無明顯差異。RNAseq結果提示一些重要的控制增殖的基因轉錄水平無明顯差異。7.肝癌組織標本免疫組織化學染色,ARID1A陰性的病人占12.17%(14/115),陽性和陰性的病人總生存率和無瘤生存率無顯著性差異。8.運用共聚焦熒光顯微鏡觀察ARID1A KO細胞,發(fā)現(xiàn)ARID1A缺失時細胞有絲分裂后期會出現(xiàn)“藕斷絲連”的染色體分離異常。運用不同的細胞周期阻斷藥物處理野生型Be17404細胞,發(fā)現(xiàn)ARID1A在細胞周期不同階段的表達量不同。流式細胞分析ARID1A∞的細胞更多停留在G2/M四倍體期。進一步用double thymidine同步細胞在G1期,釋放后,發(fā)現(xiàn)ARID1A KO的細胞更快進入G2/M期。9.對ARID1A KO和野生型Be17404肝癌細胞系用IR、UV、I質鉑處理,以r-H2A.X作為DNA損傷修復的標志,發(fā)現(xiàn)ARID1A KO的細胞系,r-H2A.X的產(chǎn)生受到抑制。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)ARIDIA和r-H2A.X之間存在相互作用。10. ARID1A KO細胞系比野生型的Be17404細胞系更加耐受IR照射,Western blot檢測Cleaved-PARP的產(chǎn)生受到抑制。裸鼠皮下成瘤后接受IR照射,免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)ARID1A KO細胞和野生型的Be17404細胞相比Cleaved-Caspase-3的產(chǎn)生受到抑制。結論：1.在小鼠中,Arid1a的突變雖不能直接導致肝臟腫瘤的產(chǎn)生,但是在不同肝癌模型中都能加速腫瘤的發(fā)生。2. ARID1A的缺失不影響肝癌細胞的增殖能力,對肝細胞肝癌的病人預后無明顯影響。3. ARID1A的失活性突變使細胞有絲分裂后期會出現(xiàn)“藕斷絲連”的染色體分離異常,可能導致異倍體,和腫瘤的產(chǎn)生有密切關系。4. ARID1A失活性突變的細胞DNA損傷修復出現(xiàn)問題,表現(xiàn)在無法誘導產(chǎn)生r-H2A.X,容易產(chǎn)生基因組不穩(wěn)定性,和腫瘤的產(chǎn)生有密切關系。5. ARID1A失活性突變的細胞能抑制IR誘導的凋亡,在腫瘤的發(fā)生過程中可能有一定作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2383686