【摘要】：結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,據(jù)國(guó)際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer)資料顯示,全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例在男性中發(fā)病率位居惡性腫瘤第3位,女性患者僅次于乳腺癌而位居第2位。我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率位于肺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌之后,居第5位。盡管在腫瘤防治以及手術(shù)、放療、化療等治療策略上都有進(jìn)步,這些僅限于在初期腫瘤的治療中有較滿意的療效,而在晚期多無(wú)法獲得根治。目前臨床迫切需求新型的更有效的治療手段進(jìn)入臨床應(yīng)用。在腫瘤研究領(lǐng)域,基因治療是一項(xiàng)有潛力的逆轉(zhuǎn)常規(guī)放化療抵抗的研究熱點(diǎn)之一。然而,基因治療的有效性及其特異性仍存在諸多挑戰(zhàn)。溶瘤病毒能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞并具備復(fù)制能力,通過(guò)直接溶瘤而殺傷腫瘤細(xì)胞。此外,溶瘤病毒還可以通過(guò)基因修飾等分子工程的操作,攜帶各種腫瘤特異治療元件產(chǎn)生抗腫瘤免疫等多種作用發(fā)揮抗癌效應(yīng)。這種將腫瘤的病毒治療與基因治療結(jié)合起來(lái)的方法,利用溶瘤病毒選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的增殖與復(fù)制,增加溶瘤病毒攜帶的抗癌基因的拷貝數(shù)量,提高其表達(dá)水平,從而增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。因此,溶瘤病毒為強(qiáng)效且特異選擇性殺傷的極具潛力的抗腫瘤方法之一�；谙俨《镜妮d體是基因轉(zhuǎn)移最廣泛應(yīng)用的平臺(tái)之一。然而,非復(fù)制潛能的腺病毒極少可以有效地清除腫瘤細(xì)胞。因此,需要極大的濃度或劑量以達(dá)到較有效的抗腫瘤反應(yīng);但是往往誘導(dǎo)宿主抗病毒免疫反應(yīng),導(dǎo)致病毒載體在隨后的組織免疫與毒性反應(yīng)過(guò)程中被中和,而失去治療作用。為克服這些局限,條件性復(fù)制潛能的腺病毒被開(kāi)發(fā)而廣泛檢測(cè)評(píng)估,這一系列的病毒可特異性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,隨后溶解腫瘤細(xì)胞并釋放子代病毒,繼續(xù)感染并殺傷鄰近的腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)的研究證實(shí),可與有復(fù)制潛能的腺病毒中和的抗體實(shí)際上對(duì)這些腺病毒作用有限,因此可以推測(cè),腫瘤特異選擇性復(fù)制潛能的腺病毒在腫瘤基因治療中極為有效。在本研究中,已應(yīng)用腫瘤特異啟動(dòng)子人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(h TERT)以及腫瘤細(xì)胞選擇性凋亡誘導(dǎo)基因凋亡素(Apoptin)構(gòu)建了重組溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a,并已經(jīng)在一系列的不同類型腫瘤細(xì)胞中如胃癌、前列腺癌中呈現(xiàn)出強(qiáng)效的抗腫瘤生長(zhǎng)與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的療效。端粒酶活性在大約90%以上的腫瘤組織內(nèi)過(guò)表達(dá),而在正常組織內(nèi)無(wú)法測(cè)出,因其腫瘤特異性強(qiáng)而作為腫瘤標(biāo)志物被廣為應(yīng)用。在端粒酶亞型中,h TERT決定永生化細(xì)胞以及85%以上人類腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性。因此,h TERT啟動(dòng)子已通過(guò)轉(zhuǎn)基因操作而達(dá)到腫瘤特異表達(dá)的效應(yīng)。另一方面,Apoptin是雞貧血病毒的VP3基因表達(dá)的產(chǎn)物,對(duì)一系列轉(zhuǎn)化或人源性惡性腫瘤包括肝癌,淋巴瘤,膽管癌,黑色素瘤以及乳腺、肺與結(jié)腸癌中呈現(xiàn)出特異性與有效性,而對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞則無(wú)促凋亡作用,因此認(rèn)為,Apoptin是一較特異的腫瘤促凋亡蛋白。目前尚無(wú)Ad-Apoptin-h TERT-E1a對(duì)結(jié)腸癌抑制作用效果的研究,本研究通過(guò)系列的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn),以檢測(cè)Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP等重組腺病毒對(duì)腫瘤組織的靶向作用,探討AdApoptin-h TERT-E1a抑制腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡的療效。實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)擬研究Ad-Apoptin-h TERT-E1a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞特異性殺傷作用,并探討Ad-Apoptin-h TERT-E1a的抑瘤率、對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用方式及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法體外實(shí)驗(yàn)中,以正常胃粘膜細(xì)胞系GES為對(duì)照組,重組腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP分別感染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116,通過(guò)MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)明確重組腺病毒的靶向作用及抑制作用方式。同時(shí),以Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP不同重組腺病毒為對(duì)照組,通過(guò)MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)明確Ad-Apoptin-h TERT-E1a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用效果。此后,通過(guò)Western blot檢測(cè)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)Caspase酶、活性氧(ROS)和線粒體膜電位(MMP)水平,進(jìn)一步檢測(cè)抑制效應(yīng)的相關(guān)機(jī)制,從分子水平對(duì)重組腺病毒的抑瘤途徑進(jìn)行研究。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,利用鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞分別構(gòu)建BALB/c小鼠實(shí)體荷瘤模型及肺轉(zhuǎn)移荷瘤模型,經(jīng)皮下注射及尾靜脈注射兩種方式接種重組腺病毒,通過(guò)觀察腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)、不同時(shí)間的抑瘤率、生存期探討Ad-Apoptin-h TERT-E1a的體內(nèi)抑瘤作用效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)MTT染色、光鏡檢測(cè)、AO/EB染色以及Annexin V染色等檢測(cè),結(jié)果顯示重組腺病毒可不同程度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其中,Ad-Apoptin-h TERT-E1a對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116的誘導(dǎo)凋亡作用最強(qiáng),而各重組腺病毒均對(duì)正常細(xì)胞系GES未見(jiàn)明顯抑制作用。MTT染色還表明,相對(duì)定量分析,Ad-Apoptin-h TERT-E1a對(duì)體外培養(yǎng)的SW1116的抑瘤作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應(yīng)以及時(shí)間依賴效應(yīng)。Western blot檢測(cè)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)caspase 3,caspase 6及caspase 7等凋亡執(zhí)行蛋白的表達(dá)水平變化,同時(shí)檢測(cè)此過(guò)程中線粒體膜電位、活性氧以及細(xì)胞色素酶C的變化。結(jié)果表明,在Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116細(xì)胞中,Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7凋亡執(zhí)行蛋白的活性明顯增強(qiáng),并伴有ROS、MMP及Cyto C的變化。結(jié)果提示,Ad-Apoptin-h TERT-E1a誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一為通過(guò)影響線粒體膜電位而啟動(dòng)內(nèi)源性激活凋亡信號(hào)通路,而對(duì)正常的胃粘膜細(xì)胞GES并產(chǎn)生影響。對(duì)兩種荷瘤模型的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,接種Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin等重組腺病毒瘤內(nèi)注射或血管用藥,均可以明顯的抑制小鼠體內(nèi)接種的腫瘤的增殖,并顯著地延長(zhǎng)小鼠模型的生存期,且未見(jiàn)明顯的毒副作用,其中Ad-Apoptin-h TERT-E1a T作用最強(qiáng)。進(jìn)一步驗(yàn)證了重組溶瘤腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。結(jié)論h TERT啟動(dòng)子調(diào)控的表達(dá)Apoptin基因的溶瘤腺病毒,即Ad-Apoptin-h TERT-E1a可使大多數(shù)SW1116腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡形態(tài),這種誘導(dǎo)凋亡的作用呈現(xiàn)出典型的劑量依賴的特征以及時(shí)間依賴特征。Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116細(xì)胞中,Caspase-3/6/7凋亡相關(guān)蛋白的活性明顯增強(qiáng),線粒體膜電位水平下調(diào),而活性氧水平及Cyto C水平上調(diào),提示Ad-Apoptin-h TERT-E1a可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖。Ad-Apoptin-h TERT-E1a的這種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的抑瘤作用具有特異的腫瘤細(xì)胞靶向性,對(duì)正常細(xì)胞無(wú)誘導(dǎo)凋亡作用。Ad-Apoptin-h TERT-E1a顯著地抑制了小鼠體內(nèi)接種腫瘤的增殖,同時(shí)可延長(zhǎng)CT26荷瘤小鼠模型的生存時(shí)間,而未見(jiàn)明顯的毒副反應(yīng)。綜上所述,Ad-Apoptin-h TERT-E1a呈現(xiàn)出應(yīng)用于抗腫瘤治療的潛力,可同時(shí)應(yīng)用于原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;表達(dá)人γ-干擾素的重組腺病毒的制備檢測(cè)[J];藥物生物技術(shù);1999年02期

2 王光明,楊陽(yáng),李愛(ài)玲,郝潔,高翔,謝蜀生;CTLA4Ig-IRES-OX40Ig重組腺病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2005年05期

3 王曉軍;王愛(ài)民;張忠榮;吳思宇;郭慶山;吳軍;賀偉峰;湯守營(yíng);張全順;;人骨保護(hù)素基因重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定[J];中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志;2005年02期

4 陳邦黨;馬翔;馬依彤;楊毅寧;劉芬;;細(xì)菌內(nèi)同源重組法快速制備重組腺病毒[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年12期

5 王德利,阮狄克,李海峰,馬巍,劉碧波,楊敏杰;骨形成蛋白2重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2004年06期

6 萬(wàn)小平;李小榮;譚輝;何峰;裴海平;申z，

本文編號(hào)：2382788