【摘要】：結腸癌是常見的惡性腫瘤之一,據(jù)國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer)資料顯示,全球結直腸癌新發(fā)病例在男性中發(fā)病率位居惡性腫瘤第3位,女性患者僅次于乳腺癌而位居第2位。我國結腸癌發(fā)病率位于肺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌之后,居第5位。盡管在腫瘤防治以及手術、放療、化療等治療策略上都有進步,這些僅限于在初期腫瘤的治療中有較滿意的療效,而在晚期多無法獲得根治。目前臨床迫切需求新型的更有效的治療手段進入臨床應用。在腫瘤研究領域,基因治療是一項有潛力的逆轉常規(guī)放化療抵抗的研究熱點之一。然而,基因治療的有效性及其特異性仍存在諸多挑戰(zhàn)。溶瘤病毒能夠特異性識別腫瘤細胞并具備復制能力,通過直接溶瘤而殺傷腫瘤細胞。此外,溶瘤病毒還可以通過基因修飾等分子工程的操作,攜帶各種腫瘤特異治療元件產(chǎn)生抗腫瘤免疫等多種作用發(fā)揮抗癌效應。這種將腫瘤的病毒治療與基因治療結合起來的方法,利用溶瘤病毒選擇性在腫瘤細胞內(nèi)的增殖與復制,增加溶瘤病毒攜帶的抗癌基因的拷貝數(shù)量,提高其表達水平,從而增強對腫瘤細胞的殺傷作用。因此,溶瘤病毒為強效且特異選擇性殺傷的極具潛力的抗腫瘤方法之一。基于腺病毒的載體是基因轉移最廣泛應用的平臺之一。然而,非復制潛能的腺病毒極少可以有效地清除腫瘤細胞。因此,需要極大的濃度或劑量以達到較有效的抗腫瘤反應;但是往往誘導宿主抗病毒免疫反應,導致病毒載體在隨后的組織免疫與毒性反應過程中被中和,而失去治療作用。為克服這些局限,條件性復制潛能的腺病毒被開發(fā)而廣泛檢測評估,這一系列的病毒可特異性地在腫瘤細胞內(nèi)復制,隨后溶解腫瘤細胞并釋放子代病毒,繼續(xù)感染并殺傷鄰近的腫瘤細胞。近年來的研究證實,可與有復制潛能的腺病毒中和的抗體實際上對這些腺病毒作用有限,因此可以推測,腫瘤特異選擇性復制潛能的腺病毒在腫瘤基因治療中極為有效。在本研究中,已應用腫瘤特異啟動子人端粒酶逆轉錄酶(h TERT)以及腫瘤細胞選擇性凋亡誘導基因凋亡素(Apoptin)構建了重組溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a,并已經(jīng)在一系列的不同類型腫瘤細胞中如胃癌、前列腺癌中呈現(xiàn)出強效的抗腫瘤生長與抑制腫瘤轉移的療效。端粒酶活性在大約90%以上的腫瘤組織內(nèi)過表達,而在正常組織內(nèi)無法測出,因其腫瘤特異性強而作為腫瘤標志物被廣為應用。在端粒酶亞型中,h TERT決定永生化細胞以及85%以上人類腫瘤細胞的端粒酶活性。因此,h TERT啟動子已通過轉基因操作而達到腫瘤特異表達的效應。另一方面,Apoptin是雞貧血病毒的VP3基因表達的產(chǎn)物,對一系列轉化或人源性惡性腫瘤包括肝癌,淋巴瘤,膽管癌,黑色素瘤以及乳腺、肺與結腸癌中呈現(xiàn)出特異性與有效性,而對非轉化細胞包括成纖維細胞、角質(zhì)細胞或平滑肌細胞則無促凋亡作用,因此認為,Apoptin是一較特異的腫瘤促凋亡蛋白。目前尚無Ad-Apoptin-h TERT-E1a對結腸癌抑制作用效果的研究,本研究通過系列的體外及體內(nèi)實驗,以檢測Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP等重組腺病毒對腫瘤組織的靶向作用,探討AdApoptin-h TERT-E1a抑制腫瘤生長并促進其凋亡的療效。實驗目的本實驗擬研究Ad-Apoptin-h TERT-E1a對結腸癌細胞特異性殺傷作用,并探討Ad-Apoptin-h TERT-E1a的抑瘤率、對結腸癌細胞的抑制作用方式及其作用機制。實驗方法體外實驗中,以正常胃粘膜細胞系GES為對照組,重組腺病毒Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP分別感染人結腸癌細胞SW1116,通過MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式細胞術明確重組腺病毒的靶向作用及抑制作用方式。同時,以Ad-EGFP-h TERT-E1a、Ad-Apoptin和Ad-EGFP不同重組腺病毒為對照組,通過MTT染色、AO/EB染色、DAPI染色和流式細胞術明確Ad-Apoptin-h TERT-E1a對結腸癌細胞的抑制作用效果。此后,通過Western blot檢測及流式細胞儀檢測Caspase酶、活性氧(ROS)和線粒體膜電位(MMP)水平,進一步檢測抑制效應的相關機制,從分子水平對重組腺病毒的抑瘤途徑進行研究。在體內(nèi)實驗中,利用鼠結腸癌CT26細胞分別構建BALB/c小鼠實體荷瘤模型及肺轉移荷瘤模型,經(jīng)皮下注射及尾靜脈注射兩種方式接種重組腺病毒,通過觀察腫瘤生長趨勢、不同時間的抑瘤率、生存期探討Ad-Apoptin-h TERT-E1a的體內(nèi)抑瘤作用效果。實驗結果通過MTT染色、光鏡檢測、AO/EB染色以及Annexin V染色等檢測,結果顯示重組腺病毒可不同程度誘導細胞凋亡,其中,Ad-Apoptin-h TERT-E1a對人結腸癌細胞SW1116的誘導凋亡作用最強,而各重組腺病毒均對正常細胞系GES未見明顯抑制作用。MTT染色還表明,相對定量分析,Ad-Apoptin-h TERT-E1a對體外培養(yǎng)的SW1116的抑瘤作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應以及時間依賴效應。Western blot檢測及流式細胞儀檢測caspase 3,caspase 6及caspase 7等凋亡執(zhí)行蛋白的表達水平變化,同時檢測此過程中線粒體膜電位、活性氧以及細胞色素酶C的變化。結果表明,在Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116細胞中,Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7凋亡執(zhí)行蛋白的活性明顯增強,并伴有ROS、MMP及Cyto C的變化。結果提示,Ad-Apoptin-h TERT-E1a誘導人結腸癌細胞凋亡的作用機制之一為通過影響線粒體膜電位而啟動內(nèi)源性激活凋亡信號通路,而對正常的胃粘膜細胞GES并產(chǎn)生影響。對兩種荷瘤模型的體內(nèi)治療實驗結果顯示,接種Ad-Apoptin-h TERT-E1a、Ad-Apoptin等重組腺病毒瘤內(nèi)注射或血管用藥,均可以明顯的抑制小鼠體內(nèi)接種的腫瘤的增殖,并顯著地延長小鼠模型的生存期,且未見明顯的毒副作用,其中Ad-Apoptin-h TERT-E1a T作用最強。進一步驗證了重組溶瘤腺病毒對腫瘤細胞的特異性殺傷作用。結論h TERT啟動子調(diào)控的表達Apoptin基因的溶瘤腺病毒,即Ad-Apoptin-h TERT-E1a可使大多數(shù)SW1116腫瘤細胞表現(xiàn)為凋亡形態(tài),這種誘導凋亡的作用呈現(xiàn)出典型的劑量依賴的特征以及時間依賴特征。Ad-Apoptin-h TERT-E1a感染后的SW1116細胞中,Caspase-3/6/7凋亡相關蛋白的活性明顯增強,線粒體膜電位水平下調(diào),而活性氧水平及Cyto C水平上調(diào),提示Ad-Apoptin-h TERT-E1a可能通過線粒體途徑誘導人結直腸癌細胞凋亡、抑制其增殖。Ad-Apoptin-h TERT-E1a的這種誘導腫瘤細胞凋亡的抑瘤作用具有特異的腫瘤細胞靶向性,對正常細胞無誘導凋亡作用。Ad-Apoptin-h TERT-E1a顯著地抑制了小鼠體內(nèi)接種腫瘤的增殖,同時可延長CT26荷瘤小鼠模型的生存時間,而未見明顯的毒副反應。綜上所述,Ad-Apoptin-h TERT-E1a呈現(xiàn)出應用于抗腫瘤治療的潛力,可同時應用于原發(fā)性與轉移性結腸癌的治療。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35

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本文編號：2382788