【摘要】：原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,在我國肝癌的發(fā)病及致死率位居全球之首。目前肝癌的治療方式有多種選擇,手術(shù)切除仍是早期肝癌的主要治療方式,但術(shù)后存在較高的復(fù)發(fā)率,且多數(shù)患者就診時已為中晚期或終末期,喪失手術(shù)機會。目前我國對喪失手術(shù)機會的中晚期肝癌的治療以射頻治療及經(jīng)肝動脈介入栓塞化療為主要方式,但其存在較多嚴重并發(fā)癥且給患者帶來較大痛苦。近年來,隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,高強度聚焦超聲(HIFU)作為新的治療手段已被廣泛應(yīng)用于臨床,在眾多腫瘤或非腫瘤性疾病的治療中取得較好的效果。HIFU治療的原理主要是通過超聲波的熱效應(yīng)來殺滅病灶,但在臨床治療腫瘤時,由于腫瘤大多位于深部組織或器官,超聲波穿透組織時不可避免的產(chǎn)生聲能衰減,同時腫瘤區(qū)域的血供豐富,能量會隨血液快速流動而衰減,這些因素都限制了HIFU治療的徹底性,降低了HIFU療效,從而導(dǎo)致了腫瘤組織不能完全被殺滅,增加了腫瘤復(fù)發(fā)的風險。相關(guān)研究表明腫瘤一旦復(fù)發(fā),其侵襲能力較原發(fā)時明顯增加。因此如何提高HIFU治療效果,降低腫瘤的殘留或復(fù)發(fā)成為目前研究熱點。隨著研究的進展,腫瘤的發(fā)生及進展與基因突變或缺失相關(guān),因此基因治療被廣大學(xué)者認為是最具潛力的治療方式。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療中最有成效的方案之一,HSV-TK/GCV系統(tǒng)是自殺基因的一種,HSV-TK本身不具備殺傷功能,其轉(zhuǎn)染進入細胞后可將無毒的GCV轉(zhuǎn)化成細胞毒性物質(zhì)進行殺傷。但如何將HSV-TK高效、安全、無創(chuàng)、無毒的轉(zhuǎn)染進入組織細胞成為限制其發(fā)展的瓶頸。近年來,靶向超聲微泡被廣泛應(yīng)用于基因的攜載,載基因微泡注入體內(nèi)后通過其表面靶向性配體、抗體與腫瘤組織受體特異性結(jié)合,從而在靶區(qū)域聚集,利用一定強度超聲體表輻照使微泡破裂,從而釋放攜帶目的基因,同時微泡破裂產(chǎn)生的空化效應(yīng)及聲孔效應(yīng),可促進細胞膜通透性增加,促進基因轉(zhuǎn)染。因此,在本實驗中,我們制備了納米級陽離子微泡,并將肝癌特異性表達的GPC3抗體進行連接構(gòu)建靶向陽離子微泡,然后再將HSV-TK質(zhì)粒與靶向陽離子微泡連接,構(gòu)建納米攜基因靶向陽離子微泡并檢測其物理性能,通過體內(nèi)、體外實驗,探討其靶向能力及HSV-TK/GCV系統(tǒng)對腫瘤的治療作用。本課題包括以下三部分：第一部分攜基因靶向超聲微泡的制備第一節(jié)納米微泡的制備及鑒定目的構(gòu)建不同類型超聲微泡用于攜帶目的基因。方法通過機械震蕩法來構(gòu)建不同的脂質(zhì)微泡,其中陽離子微泡在成膜材料中加入DC-膽固醇(DC-cholesterol)使微泡表面帶正電荷,以此來構(gòu)建陽離子微泡(CMB),在光鏡下觀察各種微泡的基本形態(tài)及均一性,檢測各種微泡的表面電位和粒徑。結(jié)果各種微泡構(gòu)建成功,光鏡下觀察兩種微泡分布均勻,粒徑大小均一,普通微泡表面電荷為-2.38±0.56 mV,呈微弱負電荷,陽離子微泡的表面電位為26.44±2.13 mV,普通微泡的粒徑為512.57±25.18nm,陽離子微泡的粒徑為502.63±21.26nm。結(jié)論兩種微泡間相互比較,電位具有顯著性差異(p0.01),粒徑間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。第二節(jié)靶向微泡的構(gòu)建及其性能檢測目的將GPC3抗體及HSV-TK質(zhì)粒與微泡連接,構(gòu)建攜基因靶向微泡。方法將制備好的陽離子微泡通過“生物素-親和素”法與靶向抗體GPC3單抗進行連接,同時將陽離子微泡與同型對照抗體連接；構(gòu)建成功的普通微泡、陽離子微泡、靶向陽離子微泡(5×108個)與質(zhì)粒(HSV-TK)共孵育,利用靜電吸附原理使二者充分結(jié)合,然后進行洗滌、離心,通過對未結(jié)合的質(zhì)粒的量進行測定來檢測不同類型微泡攜帶質(zhì)粒能力,激光共聚焦顯微鏡檢測質(zhì)粒及抗體與微泡的連接情況。結(jié)果普通攜基因微泡、陽離子攜基因微泡、靶向陽離子攜基因微泡及陽離子對照抗體微泡成功構(gòu)建,激光共聚焦下連接成功的微泡大小均一,分散度較好,激光共聚焦顯微鏡下GPC3抗體與微泡連接后呈現(xiàn)綠色熒光,HSV-TK質(zhì)粒與微泡連接后呈現(xiàn)紅色熒光,二者原位重疊后呈現(xiàn)黃色熒光,表明成功構(gòu)律靶向攜基因微泡。普通徽泡、陽離子微泡和陽離子靶向微泡攜帶HSV-TK質(zhì)粒的能力分別為0.36±0.03μg,17.91±1.15μg和17.26±2.01μg,兩組陽離子微泡之間攜帶質(zhì)粒的能力無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),陽離子微泡與普通微泡之間比較,差異具有顯著性(p0.01)。結(jié)論通過“生物素-親和素”系統(tǒng)可以將納米微泡、HSV-TK質(zhì)粒及GPC3抗體成功連接,成功構(gòu)建了納米級靶向攜基因微泡；陽離子微泡攜基因能力明顯大于普通微泡,陽離子微泡連接抗體后并不影響其攜載能力。第二部分攜HSV-TK基因的不同類型微泡尋靶和在超聲作用下轉(zhuǎn)染HEPG-2細胞的實驗研究第一節(jié)攜基因靶向微泡的體外、體內(nèi)尋靶能力檢測目的檢測普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡體外、體內(nèi)靶向?qū)ふ襀epG-2細胞的能力。方法(1)利用免疫組化法證實HepG-2細胞膜存在GPC3抗原表達；(2)利用自行設(shè)計的玻板進行HepG-2細胞培養(yǎng),使細胞貼壁,然后將細胞已貼壁的玻板翻轉(zhuǎn)并與微泡充分孵育后,再將玻板翻轉(zhuǎn),倒置顯微鏡下觀察HepG-2細胞與微泡結(jié)合數(shù),檢測不同類型微泡的體外尋靶能力；(3)裸鼠皮下注射肝癌HepG-2細胞,建立裸鼠肝癌種植瘤模型,免疫組化法證實GPC3表達于腫瘤細胞表面。不同類型微泡經(jīng)裸鼠尾靜脈注射,通過超聲腫瘤成像,檢測其體內(nèi)靶向腫瘤細胞能力。兩部分實驗中,對照抗體陽離子微泡作為陽離子靶向微泡的對照而納入實驗分組中,競爭抑制實驗被用于證實靶向陽離子微泡與靶細胞的特異性結(jié)合。結(jié)果(1)免疫組化法證實HepG-2細胞表面存在GPC3抗原表達；(2)尋靶試驗,除普通微泡外,陽離子微泡、靶向陽離子微泡、陽離子對照抗體微泡均可與表達GPC3抗原的HepG-2細胞結(jié)合,而陽離子靶向微泡與HepG-2細胞靶向結(jié)合數(shù)量最高(P0.01)；率先加入GPC3抗體孵育后,靶向陽離子微泡與HepG-2細胞結(jié)合數(shù)量明顯降低(P0.01)；而細胞與同型對照抗體共孵育后,靶向陽離子微泡與HepG-2細胞結(jié)合數(shù)量沒有明顯影響(P0.05)；(3)體內(nèi)試驗中,超聲證實：除靶向陽離子微泡外,普通微泡、陽離子微泡及陽離子對照抗體微泡均不能靶向結(jié)合表達GPC3抗體的腫瘤細胞；在超聲顯像的造影模式和傳統(tǒng)灰階模式下,與對照組相比,經(jīng)普通微泡、陽離子微泡與靶向陽離子微泡注射后,種植瘤內(nèi)均可見回聲增強；且陽離子微泡組與靶向陽離子微泡組比普通微泡組回聲更強,其中靶向陽離子微泡組回聲最強。體內(nèi)競爭抑制實驗：通過裸鼠尾靜脈注射GPC3抗體后,靶向陽離子微泡與腫瘤細胞靶向結(jié)合數(shù)量顯著降低(P0.001)。結(jié)論(1)陽離子微泡、靶向陽離子微泡及陽離子對照抗體微泡均可與表達GPC3抗原的HepG-2細胞結(jié)合,但只有靶向陽離子微泡能與HepG-2細胞靶向結(jié)合,而陽離子微泡及陽離子對照抗體微泡與HepG-2細胞結(jié)合是非特異性結(jié)合,這種結(jié)合方式的優(yōu)勢在體內(nèi)實驗中不復(fù)存在；(2)超聲顯像也證實靶向陽離子微泡體內(nèi)較好的尋靶效果,充分證實了靶向陽離子微泡體內(nèi)、體外均具有較好的靶向能力。第二節(jié)超聲作用下攜HSV-TK基因的不同類型微泡轉(zhuǎn)染HepG-2細胞的實驗研究目的 探討在超聲作用下普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡轉(zhuǎn)染HepG-2細胞的轉(zhuǎn)染效率,以及轉(zhuǎn)染后HSV-TK/GCV對細胞增殖抑制、腫瘤細胞侵襲的影響。方法實驗分空白對照組、普通微泡組、陽離子微泡組、靶向陽離子組四組,將不同類型微泡連接HSV-TK質(zhì)粒后,超聲(1 MHz,1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下轉(zhuǎn)染HepG-2細胞,轉(zhuǎn)染后檢測轉(zhuǎn)染效率,MTT檢測細胞增殖抑制率,qPCR及Western分別檢測TK、VEGF、 Caspase-3 mRNA及蛋白表達情況；通過體外HepG-2細胞侵襲實驗評價細胞的侵襲能力。結(jié)果(1)轉(zhuǎn)染24小時后各組的轉(zhuǎn)染效率分別為0.31±0.05%,2.67±0.27%,21.38±2.04%,34.39±2.93%,各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；(2)轉(zhuǎn)染后24小時行MTT檢測細胞增殖抑制率,分別為8.25±0.93%,10.01±0.85%,42.36±3.87%,58.17±5.08%,靶向陽離子微泡組細胞增殖活性降低,組間比較差異亦具統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);(3) qPCR和Western檢測：在陽離子微泡和靶向陽離子微泡組,TK和Caspase-3 mRNA及蛋白表達增加,而VEGF mRNA及蛋白表達下降,兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；(4)在腫瘤細胞侵襲實驗中,各組遷移腫瘤細胞數(shù)目分別為：61.25±4.29、66.53±5.25、63.86±4.98、34.59±2.94、24.91±2.25,各組間比較差異具有顯著性(P0.01)。結(jié)論陽離子微泡及靶向陽離子微泡組與對照組及普通微泡組比較,轉(zhuǎn)染效率明顯增高,其中靶向陽離子微泡組具有更高的轉(zhuǎn)染率及其相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng),可以明顯抑制腫瘤細胞增殖及腫瘤細胞的侵襲。第三部分超聲作用下攜HSV-TK基因的不同類型微泡轉(zhuǎn)染治療HIFU不全消融后殘余肝癌的實驗研究目的探討普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡攜HSV-TK質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染治療HIFU不全消融HepG-2種植瘤效果,觀察各組微泡對殘癌組織生長的影響及治療作用。方法(1)裸鼠左后肢皮下注射HepG-2細胞懸液建立種植瘤模型,造模后14天,裸鼠種植瘤模型建立成功,給予HIFU治療,進行不全性消融,建立殘癌模型；(2)隨機分為4組,分別為對照組(經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水)、普通微泡組(經(jīng)尾靜脈注射普通微泡)、陽離子微泡組(經(jīng)尾靜脈注射陽離子微泡)及靶向陽離子微泡組(經(jīng)尾靜脈注射靶向陽離子微泡),每組微泡均已與HSV-TK質(zhì)粒連接；(3)轉(zhuǎn)染后行活體成像掃描,并應(yīng)用圖像分析軟件評價尋靶效果；(4)尋靶成功后,普通微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡各組在超聲(1 MHz,2 W/cm2, and 50% DC,30 seconds)作用下轉(zhuǎn)染腫瘤細胞,轉(zhuǎn)染后予以GCV腹腔注射；(5)用免疫組化法檢測腫瘤組織中TK、PCNA、CD31及VEGF的表達；并通過CD31的表達計算腫瘤細胞微血管形成情況,q-PCR檢測TK. VEGF和caspase3mRNA表達；TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡；記錄荷瘤裸鼠生存時間。結(jié)果(1)HE染色證實癌細胞殘留,HIFU不全消融模型成功構(gòu)建,微泡注入后行活體成像見殘癌組織出現(xiàn)綠色熒光,HSV-TK質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染進入組織細胞；(2)免疫組化及q-PCR結(jié)果顯示除對照組外,各組均有TK蛋白表達,且陽離子靶向微泡組表達水平最高,再次證實HSV-TK基因成功轉(zhuǎn)染進入腫瘤細胞內(nèi)；(3)免疫組化及TUNEL結(jié)果顯示靶向陽離子微泡組腫瘤增殖明顯受到抑制(P0.01)、凋亡指數(shù)明顯增高(P0.01),血管生成受到明顯抑制(P0.05),生存時間明顯延長。結(jié)論(1)載HSV-TK質(zhì)粒的靶向陽離子微泡可以準確尋靶,同時聯(lián)合超聲可以促進質(zhì)粒的釋放及轉(zhuǎn)染,提高轉(zhuǎn)染效率,以達到靶向治療殘留腫瘤的效果；(2)HSV-TK/GCV系統(tǒng)可以使腫瘤增殖受到抑制、凋亡增加,血管生成及腫瘤侵襲均得到抑制,生存時間延長,可以顯著的增強HIFU治療的效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：2374966