【摘要】：背景食管癌是世界范圍內(nèi)同時也是我國最常見的惡性上皮性腫瘤之一,嚴重危害人類健康。目前針對食管癌的治療如手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療及其它綜合治療雖然有一定的治療效果,但患者的5年生存率仍然低下,腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。因此,從分子水平探討食管癌侵襲轉(zhuǎn)移機制,找到針對食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的有效治療靶點,對于延長食管癌患者的生存期及提高生活質(zhì)量有重要意義。去整合素域和金屬蛋白酶域蛋白(A Disintegrin And Metalloprotease domain,ADAMs)家族是新近發(fā)現(xiàn)的一類和基質(zhì)金屬蛋白酶共享“金屬蛋白酶區(qū)域”的基因家族,屬于跨膜糖蛋白,到目前為止,已發(fā)現(xiàn)超過40余種。該家族成員與細胞外基質(zhì)降解、基底膜的破壞、細胞遷移、細胞融合、信號傳導(dǎo)等方面緊密相連,因此,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。ADAM10是該家族的重要成員之一,定位于15q22,編碼由748個氨基酸組成的蛋白。ADAM10蛋白活化后錨定在細胞膜的表面,通過水解各種底物,包括粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs)和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。截至目前,有關(guān)ADAM10在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機制研究在國內(nèi)外尚未見報道。目的為闡明ADAM10在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其與細胞粘附分子E-cadherin的關(guān)系,本研究首先檢測食管鱗癌組織中ADAM10、E-cadherin的表達,分析它們與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。其次通過調(diào)控食管鱗癌細胞株ADAM10的表達,觀察其對細胞增殖力、侵襲遷移能力的影響以及對E-cadherin表達的調(diào)控。最后觀察食管癌裸鼠移植瘤中ADAM10對腫瘤的生長的影響及E-cadherin表達的調(diào)控。第一部分ADAM10在食管鱗狀細胞癌中的表達及其意義方法1.采用免疫組織化學(xué)方法檢測122例人食管鱗癌組織及60例正常食管粘膜組織中ADAM10和E-cadherin蛋白的表達情況。2.采用原位雜交方法檢測122例人食管鱗癌組織及60例正常食管粘膜組織中ADAM10和E-cadherin m RNA的表達情況。3.統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料采用χ~2檢驗,檢驗水準α=0.05。結(jié)果1.122例人食管鱗狀細胞癌組織中,ADAM10 m RNA和蛋白的表達明顯高于正常食管粘膜組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);ADAM10 m RNA和蛋白在食管鱗癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)(P0.05),而與性別、年齡及組織學(xué)分級無關(guān)(P0.05)。2.122例人食管鱗狀細胞癌組織中,E-cadherin mRNA和蛋白的表達明顯低于正常食管粘膜組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);E-cadherin m RNA和蛋白在食管鱗癌組織中的表達與腫瘤組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈負相關(guān)(P0.05),而與性別、年齡無關(guān)(P0.05)。3.122例人食管鱗狀細胞癌組織中,ADAM10蛋白和E-cadherin蛋白的表達呈負相關(guān)(P0.01)。第二部分ADAM10的表達調(diào)控對食管鱗癌細胞侵襲遷移能力的影響及機制研究方法1.Real-time PCR及western blot方法檢測三種食管鱗癌細胞Eca109、EC-1及TE-1 ADAM10 m RNA及蛋白表達情況,同時以原代培養(yǎng)正常食管鱗狀上皮細胞(normal esophageal epithelial cells,NEECs)作為對照。2.侵襲小室和劃痕實驗檢測三種食管鱗癌細胞Eca109、EC-1及TE-1體外侵襲和遷移能力,并觀察細胞侵襲遷移能力和ADAM10基因表達的關(guān)系。3.設(shè)計合成針對ADAM10的小干擾RNA,同時設(shè)計合成無義鏈作為陰性對照,用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000包裹轉(zhuǎn)染高侵襲食管鱗癌EC-1細胞。Real-time PCR及western blot檢測ADAM10 si RNA對ADAM10表達的抑制效果以及對E-cadherin表達的影響。4.侵襲小室、劃痕實驗及CCK-8實驗檢測ADAM10 si RNA轉(zhuǎn)染對EC-1細胞體外侵襲遷移能力及增殖能力的影響。5.統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料比較采用χ~2檢驗;計量資料采用x±s表示,比較采用t檢驗;檢驗水準α=0.05。結(jié)果1.ADAM10 m RNA及蛋白在三種食管鱗癌細胞Eca109、EC-1及TE-1中的表達均明顯高于正常食管鱗狀上皮細胞(NEECs)(P0.01),在食管鱗癌EC-1細胞中的ADAM10 m RNA及蛋白表達量最高,在TE-1細胞中表達最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.三種食管鱗癌細胞Eca109、EC-1及TE-1中,EC-1的穿膜細胞數(shù)最多,劃痕愈合能力最強,與Eca109和TE-1相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而TE-1的穿膜細胞數(shù)最少,劃痕愈合能力最弱,與Eca109和EC-1相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.EC-1細胞轉(zhuǎn)染ADAM10 si RNA 48 h后,與對照si RNA組及空白細胞組相比,ADAM10 m RNA及蛋白表達明顯下調(diào),且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4.EC-1細胞轉(zhuǎn)染ADAM10 si RNA 48 h后,與對照si RNA組及空白細胞組相比,E-cadherin m RNA及蛋白表達明顯上調(diào),且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。5.EC-1細胞轉(zhuǎn)染ADAM10 si RNA 48 h后,ADAM10 si RNA轉(zhuǎn)染組細胞穿膜細胞數(shù)及劃痕愈合能力均明顯減弱,增殖能力下降,與對照si RNA組及空白細胞組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第三部分ADAM10對食管鱗癌裸鼠移植瘤生長及E-cadherin表達的影響方法1.將食管鱗癌EC-1細胞注射到裸鼠腋下構(gòu)建食管鱗癌裸鼠移植瘤動物模型。2.將成功構(gòu)建的食管鱗癌裸鼠移植瘤動物模型隨機分成3組:ADAM10si RNA組、陰性對照si RNA組及空白細胞組。每組5只裸鼠。實驗組注射ADAM10si RNA,對照si RNA組注射無義si RNA,空白細胞組注射PBS。均采用瘤旁注射的方法進行治療,隔日1次,共15次。3.實驗結(jié)束后,取瘤稱重并計算腫瘤體積,HE染色觀察移植瘤形態(tài)學(xué)特點,real time PCR及免疫組化檢測移植瘤組織ADAM10及E-cadherin的m RNA和蛋白表達。4.統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料比較采用χ~2檢驗;計量資料采用x±s表示,兩組均數(shù)的比較采用t檢驗,多組均數(shù)的比較采用方差分析(ANVOA),檢驗水準α=0.05。結(jié)果1.與對照si RNA組和PBS處理組相比,ADAM10 si RNA處理組裸鼠移植瘤生長受抑,腫瘤體積和重量明顯減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);而對照si RNA組和PBS處理組腫瘤體積和重量無明顯差異(P0.05)。2.ADAM10 si RNA處理組裸鼠移植瘤形態(tài)學(xué)變化明顯,主要表現(xiàn)為核固縮并碎裂,并可見點、片狀壞死。3.與對照siRNA組和PBS處理組相比,ADAM10 si RNA處理組裸鼠移植瘤ADAM10 m RNA及蛋白表達下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。對照si RNA組和PBS處理組裸鼠移植瘤中ADAM10 m RNA及蛋白的表達無明顯差異(P0.05)。4.與對照si RNA組和PBS處理組相比,ADAM10 si RNA處理組裸鼠移植瘤E-cadherin m RNA及蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。對照si RNA組和PBS處理組裸鼠移植瘤中E-cadherin m RNA及蛋白的表達無明顯差異(P0.05)。結(jié)論1.ADAM10基因在食管鱗癌組織和細胞中過度表達,且與食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。提示ADAM10在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。2.在體外食管鱗癌細胞中利用RNA干擾技術(shù),能有效沉默ADAM10基因表達,并調(diào)控E-cadherin的表達,降低細胞體外侵襲、遷移力及抑制細胞增殖。提示ADAM10通過調(diào)控E-cadherin參與食管鱗癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。3.食管鱗癌裸鼠移植瘤動物模型體內(nèi)研究顯示,ADAM10 si RNA能有效降低移植瘤中ADAM10基因的表達,并調(diào)控E-cadherin表達,抑制移植瘤生長。提示ADAM10是食管鱗癌分子靶向治療的有效靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

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本文編號：2373615