發(fā)布時間：2018-12-12 00:14

【摘要】：研究背景結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是當(dāng)今全球第三大惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人類的健康。2015年我國CRC新發(fā)病例37.6萬例,死亡病例19.1萬例,五年生存率僅為44%左右,CRC已成為我國當(dāng)前亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題之一,而其發(fā)病率和死亡率居高不下的根本原因在于對其生物學(xué)病因機制缺乏突破性認(rèn)識。CRC是一種由遺傳因素和環(huán)境因素長期共同作用引起的復(fù)雜性疾病,其中,遺傳因素決定了腫瘤的易感性。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)目前已識別出一系列與CRC發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點,但該研究不能全面揭示CRC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制,且這些位點很有可能并非真正的致病位點。因此,需要對這些易感位點進(jìn)行深入挖掘,找出真正的致病位點并闡明其生物學(xué)機制。GWAS遺傳易感位點約80%位于基因組非編碼區(qū),提示其中的致病位點可能對基因表達(dá)存在調(diào)控功能,而表達(dá)數(shù)量性狀位點(expression quantitative trait loci, eQTL)分析可定位影響一個或多個基因表達(dá)水平的遺傳變異,因此,eQTL為評估非編碼區(qū)SNP的生物學(xué)機制提供了一個有效可行的策略。eQTL具有組織特異性,在腫瘤組織中進(jìn)行eQTL分析時,需要考慮體細(xì)胞及表觀遺傳對基因表達(dá)的影響。GWAS公共數(shù)據(jù)庫、DNA元件百科全書(Encyclopedia of DNA elements, ENCODE)數(shù)據(jù)庫以及癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫等的建立有助于科學(xué)家們在已有成果基礎(chǔ)上進(jìn)行數(shù)據(jù)深度解析,探尋真正致病的遺傳變異,對進(jìn)一步闡明CRC的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。研究目的1.利用TCGA數(shù)據(jù)庫探索CRC GWAS遺傳易感區(qū)域內(nèi)的eQTL;2.分析這些eQTL與中國漢族人群CRC發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)；3.尋找這些eQTL中真正致病的遺傳變異,并進(jìn)行功能學(xué)研究初探。研究方法1.從TCGA數(shù)據(jù)庫下載CRC相關(guān)數(shù)據(jù)集,人群分層分析后采用兩次線性回歸模型,在校正了體細(xì)胞拷貝數(shù)變異和甲基化對基因表達(dá)水平的影響后,評估CRCGWAS遺傳易感區(qū)域內(nèi)標(biāo)簽SNP及連鎖不平衡SNP與基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性,即整合的順式和反式eQTL分析,并通過ENCODE^ Cistrome等生物信息學(xué)工具進(jìn)行模塊分析,找出反式eQTL中存在中間媒介——轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)的遺傳位點。2.整合eQTL分析所獲得的SNP位點通過HaploView軟件排除冗余后,采用Sequenom MassARRAY中通量基因分型平臺,對北京地區(qū)768例CRC病例和768例健康對照進(jìn)行基因分型檢測,采用非條件logistic回歸分析篩選出陽性關(guān)聯(lián)SNP。3.通過RegulomeDB、rSNPBase、ANNOVAR、GWAVA等多種生物信息學(xué)預(yù)測工具,對陽性關(guān)聯(lián)SNP緊密連鎖區(qū)域進(jìn)行綜合分析,篩選出潛在功能性位點。4.對這些潛在功能性位點,使用TaqMan基因分型技術(shù)進(jìn)行兩階段病例對照研究,共納入1833例CRC病例和2758例健康對照,分析其與CRC發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)。5.對綜合以上分析所獲得的潛在功能性位點,利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪湍z遷移或電泳遷移率實驗進(jìn)行生物學(xué)功能探索,以確認(rèn)其在遺傳病因中的重要作用機制。研究結(jié)果1.TCGA數(shù)據(jù)庫中254個歐洲人種CRC個體進(jìn)行整合順式eQTL分析發(fā)現(xiàn)54個SNP與8個受調(diào)控基因組成的58對eQTL關(guān)聯(lián)(經(jīng)錯誤發(fā)現(xiàn)率校正后P0.1),其中有5個基因在腫瘤組織和正常組織中存在差異表達(dá)。反式eQTL及模塊分析共發(fā)現(xiàn)15個SNP及相應(yīng)的2個TF (MYC、ATF1)。2. Haploview軟件刪除冗余位點后,共有16個候選SNP納入第一階段中國人群關(guān)聯(lián)研究。經(jīng)Bonferroni校正后,共發(fā)現(xiàn)5個SNP(rs6983267、rs174449、rs11169524. rs4768924、rs4500718)在多個模型下與CRC發(fā)病風(fēng)險存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)。分別以各自主要等位基因為參照,加性模型下的結(jié)果分別為：rs6983267,比值比(odds ratio, OR)=1.32,95%置信區(qū)間(confidence interval, CI)=1.14-1.53,P=0.0002; rs174449, OR=0.70,95% CI=0.59-0.83, P=4.25×10-5; rs11169524, OR=1.33,95% CI=1.13-1.55, P=0.0004; rs4768924, OR=0.75,95% CI=0.64-0.88,P=0.0003; rs4500718,OR=0.68,95% CI=0.57-0.81,P=2.28×10-5。3.使用多種生物信息學(xué)工具綜合分析后,從rs11169524、rs4768924、rs4500718這3個陽性關(guān)聯(lián)SNP緊密連鎖區(qū)域各篩選出一個最具潛在功能的SNP(rs61926301,rs12424860,rs16260)。4.第一階段北京地區(qū)人群關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)rs61926301,rs12424860與CRC發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學(xué)意義,加性模型結(jié)果分別為：OR=1.34,95% CI=1.14-1.57, P=0.00035; OR=0.74,95% CI=0.63-0.86,P=9.82×10-5。第二階段武漢地區(qū)人群關(guān)聯(lián)分析,只有rs61926301與CRC發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān),加性模型結(jié)果為OR=1.22, 95% CI=1.09-1.37, P=0.0006。兩獨立樣本合并后,rs61926301 GT遺傳變異在各個模型下均與CRC發(fā)病風(fēng)險升高顯著相關(guān)(共顯性模型：GT vs GG:OR=1.27,95% CI=1.12-1.44,P=0.0003; TT vs GG:OR=1.59,95% CI=1.29-1.96,P=1.1×10-5;顯性模型：OR=1.32,95% CI=1.17-1.49,6隱性模型：OR=1.41,95% CI=1.16-1.72,P=0.0006;加性模型：OR=1.26,95% CI=1.15-1.38, P=1.0×10-6)。5.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示含rs61926301 T等位基因的片段較含G等位基因的片段有更高的啟動子活性(PSW4800.0001; PHCT116=0.0224),同時凝膠遷移或電泳遷移率實驗也顯示含rs61926301 T等位基因的片段較含G等位基因的片段有更強的TF結(jié)合能力。研究結(jié)論1.位于ATF1基因5’非翻譯區(qū)的rs61926301 GT遺傳變異與中國人群CRC發(fā)病風(fēng)險增加顯著相關(guān)。2. rs61926301 GT遺傳變異可能是通過提高所在區(qū)域的啟動子活性,使其與相應(yīng)TF的結(jié)合能力增強,導(dǎo)致其調(diào)控的ATF1、DIP2B等靶基因表達(dá)水平升高,繼而增加了CRC的發(fā)病風(fēng)險。該位點的功能為本研究首次發(fā)現(xiàn),其更加深入的生物學(xué)作用機制仍有待進(jìn)一步的研究探索。創(chuàng)新點1.本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中254例CRC樣本的基因型、RNA測序等相關(guān)數(shù)據(jù)對CRC GWAS遺傳易感位點進(jìn)行深度挖掘,在節(jié)約實驗成本的基礎(chǔ)上,樣本量也較以往的研究更大,eQTL分析的效能更高。2.本研究將影響腫瘤組織基因表達(dá)的體細(xì)胞遺傳和表觀遺傳因素也考慮在內(nèi),采用整合eQTL的方法,更好地探究生殖系遺傳變異對靶基因的調(diào)控作用,結(jié)果可信度更高。3.本研究通過中國人群病例對照關(guān)聯(lián)研究篩選、多種生物信息學(xué)功能預(yù)測及功能學(xué)實驗驗證等多種方法對eQTL分析所發(fā)現(xiàn)的遺傳位點進(jìn)行深入挖掘,找到隱藏其中的真正的致病位點并進(jìn)行了功能學(xué)初探。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
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本文編號：2373505