【摘要】：乳腺癌是導(dǎo)致患癌婦女死亡的主要原因。盡管局部控制的治療方法有了改善，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)仍然難以治愈，更好的了解促進(jìn)疾病進(jìn)展的生物學(xué)基礎(chǔ)是非常重要的。乳腺癌是導(dǎo)致全世界患癌婦女死亡的第二病因，2012年共診斷1700萬新病例，且有522000人死亡。自2008年起，乳腺癌的發(fā)病率增至20%以上，死亡率增至14%［1］。隨著乳腺癌篩查和治療的發(fā)展，大約80%病灶局限的患者可獲得生存期延長。然而，沒有證據(jù)表明轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)能使生存獲益，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的發(fā)展仍然難以控制［2］，重視并深入理解引起疾病進(jìn)展的機(jī)制非常重要，并為開展新的治療策略提供理論依據(jù)。 微小RNA（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼RNAs，在基因的負(fù)調(diào)節(jié)中通過對(duì)mRNAs靶點(diǎn)的翻譯抑制或降低起重要作用［3］。miRNA具有調(diào)節(jié)一系列生物進(jìn)程的特征，包括發(fā)育，分化，凋亡和癌癥發(fā)生發(fā)展［4］。miRNAs可作為癌基因或腫瘤抑制物發(fā)揮作用，并且有獨(dú)特的能力調(diào)節(jié)許多蛋白編碼基因［5］。單個(gè)miRNA可潛在的調(diào)節(jié)幾百個(gè)或上千個(gè)基因［6］。近幾年，miRNAs在人類癌癥中的作用被廣泛研究，并發(fā)現(xiàn)許多人類癌癥中miRNAs的表達(dá)異常。大量的證據(jù)表明某些微小RNAs可能在高危病人中起選擇性工具的作用，或者miRNAs自身可被視為治療的靶點(diǎn)［4］�，F(xiàn)已充分表明，乳腺癌中miRNAs的異常調(diào)節(jié)。miR-10b是第一個(gè)被描述的乳腺癌相關(guān)微小RNA，它在轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且正調(diào)節(jié)乳腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲［7］。miR-155和miR-21被證實(shí)是通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵耐藥相關(guān)蛋白誘導(dǎo)化療藥耐藥［8］。miR221/222被證實(shí)在體外通過針對(duì)細(xì)胞周期抑制物p27-Kip1和Era實(shí)現(xiàn)抗內(nèi)分泌耐藥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)［9］。miR-193b的調(diào)節(jié)異常在淋巴瘤［10］，頭頸部鱗癌［11］，非小細(xì)胞肺癌［12］和前列腺癌［13］中有過報(bào)道。然而，目前仍不了解miR193-b和他們的靶點(diǎn)之間的是如何相互作用導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的。因此，我們報(bào)道了miR-193b在原發(fā)人乳腺癌細(xì)胞系中的向下調(diào)節(jié)作用，并且確認(rèn)了DNAJC13（HPS40）和RAB22A是miR193b潛在的作用的靶點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)RAS癌基因通路，強(qiáng)調(diào)了miR-193b在乳腺癌進(jìn)展中的生物重要性。 目的： 檢測(cè)miR-193b在人類正常乳腺上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討miR-193b的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移浸潤、腫瘤形成中的作用。并通過使用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)算法用來對(duì)miR-193b的作用靶點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)。 方法： miRNA的實(shí)時(shí)定量PCR和mRNAs的表達(dá)：利用real-timeRT-PCR技術(shù)，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A檢測(cè)miR-193b的表達(dá)水平。 將化學(xué)合成的陰性干擾對(duì)照（negative-scramble control，SC）和pre-miR-193b mimic分子分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，利用real-timeRT-PCR技術(shù)檢測(cè)空白轉(zhuǎn)染組、陰性干擾轉(zhuǎn)染組、pre-miR-193bmimic轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中miR-193b的表達(dá)，以證實(shí)轉(zhuǎn)染效果。 使用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)negative-scramblecontrol、pre-miR-193b mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。 細(xì)胞增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)：MTT用于評(píng)估細(xì)胞增殖和pre-miR-193b mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后的細(xì)胞毒性。細(xì)胞用SC對(duì)照、pre-miR-193b，Lipofectamine2000逆轉(zhuǎn)錄，并接種于96孔板（5×103/孔）。轉(zhuǎn)染24、48、72小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活率�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)pre-miR-193b對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的作用。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于12孔板。48小時(shí)后，收集細(xì)胞并按500/ml重新接種于6孔板（重復(fù)3次）。孵育14天后，固定并染色培養(yǎng)板，進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。存活細(xì)胞數(shù)與SC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行比較。 采用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將pre-miR-193b mimic、negative-scramble control轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，觀察乳腺癌細(xì)胞形成腺泡樣結(jié)構(gòu)的能力是否受到影響。MCF-7細(xì)胞接種于8孔細(xì)胞培養(yǎng)切片（champered slide）中，在含有人工基質(zhì)膠（Matrigel）的培養(yǎng)環(huán)境中孵育14天后，觀察乳腺癌細(xì)胞形成腺泡樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量和直徑變化。 用6種miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件：miRanda, mi-RDB, miRWalk,PICTAR5, RNA-22和TargetScan來預(yù)測(cè)miR-193b潛在的靶點(diǎn)。 熒光素酶報(bào)告：因?yàn)橄掠伟谢蚺cmiR-193b的結(jié)合位點(diǎn)是它們的3'-UTR區(qū)，用PCR擴(kuò)增了DNAJC13（HPS40）和RAB22A基因的一個(gè)區(qū)域，并在pMIRREPORT熒光素酶載體中螢火蟲熒光素酶基因的下游構(gòu)建靶基因。一個(gè)變異序列克隆后作為驗(yàn)證質(zhì)粒。pMirluciferase或pMir-luciferase_gene特異載體與pre-miR-193b或SC共同轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞系中。含有海腎熒光素酶的pRL-SV載體作為對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)螢火蟲和海腎熒光素酶的活性進(jìn)行檢測(cè)。 建立小鼠乳腺癌細(xì)胞接種模型， pre-miR-193b mimic和negative-scramble control轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，接種于4~5周齡雌性NOD/SCID小鼠皮下脂肪墊內(nèi)。記錄小鼠體重變化情況，測(cè)量腫瘤體積變化，1個(gè)月后處死小鼠，測(cè)量腫瘤重量，觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移情況。 結(jié)果： 1.乳腺癌細(xì)胞系中miR-193b的表達(dá)水平 用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231與正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A檢測(cè)miR-193b的表達(dá)。與正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A相比較，miR-193b的表達(dá)水平在這兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中顯著地減少， MCF-7細(xì)胞系中減少70%，MDA-MB-231細(xì)胞系中減少82%，這與已發(fā)表的microRNA的蛋白質(zhì)微陣列的研究結(jié)果一致。 2.miR-193b的過表達(dá)顯著地減弱細(xì)胞增殖能力和小鼠成瘤能力 乳腺癌細(xì)胞用40nmol/L的SC或pre-miR-193b mimic轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，與SC轉(zhuǎn)染組比較，可觀察到miR-193bmimic轉(zhuǎn)染后，miR-193b表達(dá)水平的持續(xù)升高，MCF-7細(xì)胞系中表達(dá)水平升高超過30倍，MDA-MB-231細(xì)胞系中升高18倍。miR-193bmimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，導(dǎo)致了細(xì)胞活力的下降，轉(zhuǎn)染后48、72小時(shí)與對(duì)照比較分別為65%和50%。miR-193b過表達(dá)同樣導(dǎo)致了MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的顯著降低，存活分?jǐn)?shù)與SC比較為22%比45%。Pre-miR-193b mimic和SC分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，在三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14天后各組細(xì)胞均可形成腺泡樣結(jié)構(gòu)，與SC組相比，pre-miR-139bmimic轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后所形成的腺泡樣結(jié)構(gòu)直徑（減小47.6%）、數(shù)量（減少34.2%），均明顯小于SC組（p＜0.05）。觀察pre-miR-193b mimic轉(zhuǎn)染組，SC轉(zhuǎn)染組和空白組中小鼠接種MDA-MB-231細(xì)胞后的腫瘤形成情況。與SC組相比，腫瘤體積（減少37.8%）和重量（減少30.1%）明顯減少（p＜0.05）。 3.miR-193b調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和浸潤 為了解miR-193b是否與細(xì)胞遷移或浸潤的調(diào)節(jié)有關(guān)，使用體外穿孔（transwell）遷移和浸潤實(shí)驗(yàn)。與它們相應(yīng)的陰性對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染pre-miR-193b mimic顯著地減弱了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力。此外，轉(zhuǎn)染pre-miR-193bmimic同樣顯著地減弱了MDA-MB-231細(xì)胞的浸潤能力。 4.miR-193b潛在mRNA靶點(diǎn)的確定 我們使用6種miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件：miRanda，mi-RDB，miRWalk，PICTAR5， RNA-22和TargetScan來預(yù)測(cè)miR-193b潛在的靶點(diǎn)。3個(gè)最可能的mRNAs被選出作進(jìn)一步確認(rèn)：DNAJC13(Hsp40或RME-8)是一個(gè)DNA域結(jié)合蛋白，是Hsp70的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)；ERBB4（ViralOncogene Homolog-Like4）與細(xì)胞有絲分裂及分化有關(guān)系；RAB22A（RAS癌基因家族成員）參與細(xì)胞內(nèi)吞作用和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸。 首先，我們用qRT-PCR評(píng)估了正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7、MDA-MB-231）中DNAJC13, ERBB4和RAB22A的基線水平。與正常對(duì)照相比，DNAJC13和RAB22A的表達(dá)水平在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中都顯著地增加。ERBB4與正常對(duì)照相比，僅在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)增加，而在MCF-7細(xì)胞中則表現(xiàn)為降低。當(dāng)把pre-miR-193b mimic（40nM）轉(zhuǎn)染入這些細(xì)胞系后，與正常對(duì)照比較，DNAJC13和RAB22A在兩個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)均減少。 下一步，，為了確定miR-193b對(duì)DNAJC13和RAB22A的調(diào)節(jié)是否通過結(jié)合它們的3'-UTR，我們利用pMIR-Report載體，在其螢火蟲熒光素酶基因的下游構(gòu)建了幾個(gè)攜帶有預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)道載體。對(duì)于熒光素酶檢測(cè)，MDA-MB-231細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染pre-miR-193b（或negative-scramble control）和pmiR-DNAJC133’-UTR （或突變的pmiR-DNAJC133’-UTR）。含有DNAJC133’-UTR的報(bào)道載體被pre-miR-193b顯著地抑制，而突變的報(bào)道載體不受影響。當(dāng)我們使用pmiR-RAB22A3’-UTR (或突變的pmiR-RAB22A)在這個(gè)細(xì)胞系中得出了相同的結(jié)果。 結(jié)論： miR-193b是一個(gè)新的乳腺癌腫瘤抑制性miRNA。 mir-193b至少通過對(duì)轉(zhuǎn)錄因子DNAJC13的調(diào)節(jié)，以及對(duì)癌基因RAB22A的調(diào)控發(fā)揮作用。 miR-193b下調(diào)的結(jié)果包括在體外促進(jìn)細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和浸潤；在體內(nèi)促進(jìn)小鼠腫瘤接種模型的生長。 乳腺癌的侵襲性行為的機(jī)制可能與miR-193b~DNAJC13或miR-193b~RAB22A軸有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2370790