【摘要】：乳腺癌是導(dǎo)致患癌婦女死亡的主要原因。盡管局部控制的治療方法有了改善，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)仍然難以治愈，更好的了解促進疾病進展的生物學(xué)基礎(chǔ)是非常重要的。乳腺癌是導(dǎo)致全世界患癌婦女死亡的第二病因，2012年共診斷1700萬新病例，且有522000人死亡。自2008年起，乳腺癌的發(fā)病率增至20%以上，死亡率增至14%［1］。隨著乳腺癌篩查和治療的發(fā)展，大約80%病灶局限的患者可獲得生存期延長。然而，沒有證據(jù)表明轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)能使生存獲益，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的發(fā)展仍然難以控制［2］，重視并深入理解引起疾病進展的機制非常重要，并為開展新的治療策略提供理論依據(jù)。 微小RNA（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼RNAs，在基因的負(fù)調(diào)節(jié)中通過對mRNAs靶點的翻譯抑制或降低起重要作用［3］。miRNA具有調(diào)節(jié)一系列生物進程的特征，包括發(fā)育，分化，凋亡和癌癥發(fā)生發(fā)展［4］。miRNAs可作為癌基因或腫瘤抑制物發(fā)揮作用，并且有獨特的能力調(diào)節(jié)許多蛋白編碼基因［5］。單個miRNA可潛在的調(diào)節(jié)幾百個或上千個基因［6］。近幾年，miRNAs在人類癌癥中的作用被廣泛研究，并發(fā)現(xiàn)許多人類癌癥中miRNAs的表達異常。大量的證據(jù)表明某些微小RNAs可能在高危病人中起選擇性工具的作用，或者miRNAs自身可被視為治療的靶點［4］。現(xiàn)已充分表明，乳腺癌中miRNAs的異常調(diào)節(jié)。miR-10b是第一個被描述的乳腺癌相關(guān)微小RNA，它在轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞中高表達，并且正調(diào)節(jié)乳腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲［7］。miR-155和miR-21被證實是通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵耐藥相關(guān)蛋白誘導(dǎo)化療藥耐藥［8］。miR221/222被證實在體外通過針對細(xì)胞周期抑制物p27-Kip1和Era實現(xiàn)抗內(nèi)分泌耐藥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)［9］。miR-193b的調(diào)節(jié)異常在淋巴瘤［10］，頭頸部鱗癌［11］，非小細(xì)胞肺癌［12］和前列腺癌［13］中有過報道。然而，目前仍不了解miR193-b和他們的靶點之間的是如何相互作用導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的。因此，我們報道了miR-193b在原發(fā)人乳腺癌細(xì)胞系中的向下調(diào)節(jié)作用，并且確認(rèn)了DNAJC13（HPS40）和RAB22A是miR193b潛在的作用的靶點，通過調(diào)節(jié)RAS癌基因通路，強調(diào)了miR-193b在乳腺癌進展中的生物重要性。 目的： 檢測miR-193b在人類正常乳腺上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達水平，探討miR-193b的表達在腫瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移浸潤、腫瘤形成中的作用。并通過使用計算機預(yù)測算法用來對miR-193b的作用靶點進行確認(rèn)。 方法： miRNA的實時定量PCR和mRNAs的表達：利用real-timeRT-PCR技術(shù)，對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A檢測miR-193b的表達水平。 將化學(xué)合成的陰性干擾對照（negative-scramble control，SC）和pre-miR-193b mimic分子分別瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，利用real-timeRT-PCR技術(shù)檢測空白轉(zhuǎn)染組、陰性干擾轉(zhuǎn)染組、pre-miR-193bmimic轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中miR-193b的表達，以證實轉(zhuǎn)染效果。 使用Transwell遷移實驗、侵襲實驗，檢測negative-scramblecontrol、pre-miR-193b mimic瞬時轉(zhuǎn)染對乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。 細(xì)胞增殖和克隆形成實驗：MTT用于評估細(xì)胞增殖和pre-miR-193b mimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后的細(xì)胞毒性。細(xì)胞用SC對照、pre-miR-193b，Lipofectamine2000逆轉(zhuǎn)錄，并接種于96孔板（5×103/孔）。轉(zhuǎn)染24、48、72小時后測定細(xì)胞存活率�？寺⌒纬蓪嶒炗糜谠u價pre-miR-193b對MDA-MB-231細(xì)胞的作用。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于12孔板。48小時后，收集細(xì)胞并按500/ml重新接種于6孔板（重復(fù)3次）。孵育14天后，固定并染色培養(yǎng)板，進行克隆計數(shù)。存活細(xì)胞數(shù)與SC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進行比較。 采用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將pre-miR-193b mimic、negative-scramble control轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，觀察乳腺癌細(xì)胞形成腺泡樣結(jié)構(gòu)的能力是否受到影響。MCF-7細(xì)胞接種于8孔細(xì)胞培養(yǎng)切片（champered slide）中，在含有人工基質(zhì)膠（Matrigel）的培養(yǎng)環(huán)境中孵育14天后，觀察乳腺癌細(xì)胞形成腺泡樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量和直徑變化。 用6種miRNA靶點預(yù)測軟件：miRanda, mi-RDB, miRWalk,PICTAR5, RNA-22和TargetScan來預(yù)測miR-193b潛在的靶點。 熒光素酶報告：因為下游靶基因與miR-193b的結(jié)合位點是它們的3'-UTR區(qū)，用PCR擴增了DNAJC13（HPS40）和RAB22A基因的一個區(qū)域，并在pMIRREPORT熒光素酶載體中螢火蟲熒光素酶基因的下游構(gòu)建靶基因。一個變異序列克隆后作為驗證質(zhì)粒。pMirluciferase或pMir-luciferase_gene特異載體與pre-miR-193b或SC共同轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞系中。含有海腎熒光素酶的pRL-SV載體作為對照進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，用雙熒光素酶報告實驗對螢火蟲和海腎熒光素酶的活性進行檢測。 建立小鼠乳腺癌細(xì)胞接種模型， pre-miR-193b mimic和negative-scramble control轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，接種于4~5周齡雌性NOD/SCID小鼠皮下脂肪墊內(nèi)。記錄小鼠體重變化情況，測量腫瘤體積變化，1個月后處死小鼠，測量腫瘤重量，觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移情況。 結(jié)果： 1.乳腺癌細(xì)胞系中miR-193b的表達水平 用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231與正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A檢測miR-193b的表達。與正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A相比較，miR-193b的表達水平在這兩個乳腺癌細(xì)胞系中顯著地減少， MCF-7細(xì)胞系中減少70%，MDA-MB-231細(xì)胞系中減少82%，這與已發(fā)表的microRNA的蛋白質(zhì)微陣列的研究結(jié)果一致。 2.miR-193b的過表達顯著地減弱細(xì)胞增殖能力和小鼠成瘤能力 乳腺癌細(xì)胞用40nmol/L的SC或pre-miR-193b mimic轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，與SC轉(zhuǎn)染組比較，可觀察到miR-193bmimic轉(zhuǎn)染后，miR-193b表達水平的持續(xù)升高，MCF-7細(xì)胞系中表達水平升高超過30倍，MDA-MB-231細(xì)胞系中升高18倍。miR-193bmimic轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，導(dǎo)致了細(xì)胞活力的下降，轉(zhuǎn)染后48、72小時與對照比較分別為65%和50%。miR-193b過表達同樣導(dǎo)致了MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的顯著降低，存活分?jǐn)?shù)與SC比較為22%比45%。Pre-miR-193b mimic和SC分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，在三維培養(yǎng)條件下培養(yǎng)14天后各組細(xì)胞均可形成腺泡樣結(jié)構(gòu)，與SC組相比，pre-miR-139bmimic轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后所形成的腺泡樣結(jié)構(gòu)直徑（減小47.6%）、數(shù)量（減少34.2%），均明顯小于SC組（p＜0.05）。觀察pre-miR-193b mimic轉(zhuǎn)染組，SC轉(zhuǎn)染組和空白組中小鼠接種MDA-MB-231細(xì)胞后的腫瘤形成情況。與SC組相比，腫瘤體積（減少37.8%）和重量（減少30.1%）明顯減少（p＜0.05）。 3.miR-193b調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和浸潤 為了解miR-193b是否與細(xì)胞遷移或浸潤的調(diào)節(jié)有關(guān)，使用體外穿孔（transwell）遷移和浸潤實驗。與它們相應(yīng)的陰性對照比較，轉(zhuǎn)染pre-miR-193b mimic顯著地減弱了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力。此外，轉(zhuǎn)染pre-miR-193bmimic同樣顯著地減弱了MDA-MB-231細(xì)胞的浸潤能力。 4.miR-193b潛在mRNA靶點的確定 我們使用6種miRNA靶點預(yù)測軟件：miRanda，mi-RDB，miRWalk，PICTAR5， RNA-22和TargetScan來預(yù)測miR-193b潛在的靶點。3個最可能的mRNAs被選出作進一步確認(rèn)：DNAJC13(Hsp40或RME-8)是一個DNA域結(jié)合蛋白，是Hsp70的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點；ERBB4（ViralOncogene Homolog-Like4）與細(xì)胞有絲分裂及分化有關(guān)系；RAB22A（RAS癌基因家族成員）參與細(xì)胞內(nèi)吞作用和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸。 首先，我們用qRT-PCR評估了正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和兩個乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7、MDA-MB-231）中DNAJC13, ERBB4和RAB22A的基線水平。與正常對照相比，DNAJC13和RAB22A的表達水平在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中都顯著地增加。ERBB4與正常對照相比，僅在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達增加，而在MCF-7細(xì)胞中則表現(xiàn)為降低。當(dāng)把pre-miR-193b mimic（40nM）轉(zhuǎn)染入這些細(xì)胞系后，與正常對照比較，DNAJC13和RAB22A在兩個細(xì)胞系中的表達均減少。 下一步，，為了確定miR-193b對DNAJC13和RAB22A的調(diào)節(jié)是否通過結(jié)合它們的3'-UTR，我們利用pMIR-Report載體，在其螢火蟲熒光素酶基因的下游構(gòu)建了幾個攜帶有預(yù)測結(jié)合位點的報道載體。對于熒光素酶檢測，MDA-MB-231細(xì)胞同時轉(zhuǎn)染pre-miR-193b（或negative-scramble control）和pmiR-DNAJC133’-UTR （或突變的pmiR-DNAJC133’-UTR）。含有DNAJC133’-UTR的報道載體被pre-miR-193b顯著地抑制，而突變的報道載體不受影響。當(dāng)我們使用pmiR-RAB22A3’-UTR (或突變的pmiR-RAB22A)在這個細(xì)胞系中得出了相同的結(jié)果。 結(jié)論： miR-193b是一個新的乳腺癌腫瘤抑制性miRNA。 mir-193b至少通過對轉(zhuǎn)錄因子DNAJC13的調(diào)節(jié)，以及對癌基因RAB22A的調(diào)控發(fā)揮作用。 miR-193b下調(diào)的結(jié)果包括在體外促進細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和浸潤；在體內(nèi)促進小鼠腫瘤接種模型的生長。 乳腺癌的侵襲性行為的機制可能與miR-193b~DNAJC13或miR-193b~RAB22A軸有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉清;呂國棟;鄭樹濤;劉濤;林仁勇;盧曉梅;;新疆哈薩克族食管鱗癌中微小RNA let-7的表達及病理生物學(xué)意義[J];疾病預(yù)防控制通報;2011年02期

2 曹毅;揭志剛;李正榮;;胃癌相關(guān)microRNA研究進展[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年07期

3 岳宏宇;劉文天;;miRNA的表達調(diào)控及其在消化系腫瘤中的應(yīng)用前景[J];國際消化病雜志;2010年04期

4 李娟;張小燕;郜恒駿;;消化道腫瘤microRNA研究進展[J];國際消化病雜志;2010年04期

5 杜黎黎;李艷;盧忠心;陳衛(wèi)群;;MicroRNAs在p53信號通路中的調(diào)節(jié)作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年05期

6 蔡建英;楊效東;周明川;;上調(diào)miR-21表達水平對胃癌Kato Ⅲ細(xì)胞中CD44 mRNA及蛋白表達的影響[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

7 Stella Chai;Stephanie Ma;;Clinical implications of microRNAs in liver cancer stem cells[J];癌癥(英文版);2013年08期

8 孫衍昶;郭t$t$;賽克;王翦;王潔;陳芙蓉;張宗平;陳忠平;;MicroRNA-181b提高U87細(xì)胞對VM-26的敏感性研究[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2013年02期

9 汪章勛;周權(quán);孟慧敏;張軍;黃勃;;金龜子綠僵菌MicroRNA在蟬蛻和蠶血淋巴誘導(dǎo)下的差異表達分析[J];安徽科技學(xué)院學(xué)報;2013年05期

10 于瀟華;郭小芳;田智;粟敏;劉立鵬;;微核糖核酸對血管生成相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用[J];長沙醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年03期

相關(guān)會議論文 前9條

1 Ruiwen Fan;Shanshan Yang;Zhanquan Shi;Kaiyuan Ji;Xiaoyun Jia;Jianbo Yao;George W Smith;Changsheng Dong;;Identification of a novel miRNA important for melanogenesis in alpaca(Lama Pacos)[A];2013中國駝業(yè)進展[C];2013年

2 曾清華;周箐;康秀華;;血清microRNA的檢測及在肺癌診斷中應(yīng)用的進展[A];江西省第二次中西醫(yī)結(jié)合呼吸疾病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2012年

3 Xuan Pan;Rui Wang;Zhao-Xia Wang;;The Potential Role of MiR-451 in Cancer Diagnosis,Prognosis,and Therapy[A];2013華東胸部腫瘤論壇暨第六屆浙江省胸部腫瘤論壇論文集[C];2013年

4 秦燕;張玲云;張德玖;;核糖體展示技術(shù)在非編碼核酸研究中的應(yīng)用[A];生命科學(xué)——專題：RNA研究的新技術(shù)和新方法（第26卷第3期）[C];2014年

5 李文峰;鐘伯雄;蘇松坤;;蜜蜂級型分化機理[A];2014年全國蜂產(chǎn)品市場信息交流會暨中國（哈爾濱）蜂業(yè)博覽會論文集[C];2014年

6 宋毅;謝延風(fēng);張鈴鐺;馮清林;劉明冬;張鵬;范仕兵;杜江峰;;MiRNA在垂體泌乳素腺瘤中表達的初步研究[A];全國高血壓防治知識推廣培訓(xùn)班暨健康血壓中國行海南�？跁撐木C合刊[C];2014年

7 陳軼;陳益耀;蔡曼妮;巫華志;;非酒精性脂肪性肝病患者血清miR-29b水平變化及臨床意義[A];中國轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和整合醫(yī)學(xué)研討會論文綜合刊[C];2015年

8 Junli Guo;Shaoping Zheng;Zhihong Weng;Keping Xie;Shaojiang Zheng;;Molecular Biomarkers of Pancreatic Intraepithelial Neoplasias and Implications in Early Diagnosis and Therapeutic Intervention[A];第七屆生命科學(xué)聯(lián)合學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2015年

9 Shaosheng Wang;Xiaohong Zhao;Jie Wang;Yingmei Wen;LinJing Zhang;Dezhu Wang;Huili Chen;Qiuxia Chen;Wei Xiang;;Upregulation of micro RNA-203 is associated with advanced tumor progression and poorprognosis in epithelial ovarian cancer[A];第七屆生命科學(xué)聯(lián)合學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2015年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 熊明霞;microRNA在腎間質(zhì)纖維化中作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

2 賈筱琴;miR-199a對肝癌的抑制作用及分子機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

3 王旭東;miRNA-21調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長與耐藥機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

4 陳兆國;上海地區(qū)動物隱孢子蟲病分子流行病學(xué)調(diào)查及微小隱孢子蟲miRNA的初步鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

5 侯志波;miRNA-146a在胃癌中的表達及功能研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

6 林晨;維吾爾族婦女子宮頸癌微小RNA差異表達及其與靶基因關(guān)系的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2011年

7 于洋;轉(zhuǎn)化生長因子β雙向調(diào)控mut S同種組織蛋白2表達的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2011年

8 羅茂;玉米抗紋枯病相關(guān)miRNA鑒定及功能分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

9 李皓;雷公藤甲素通過miR-21調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞藥物敏感性的分子機制[D];江蘇大學(xué);2012年

10 曾四平;Has-mir-129調(diào)控SN12-PM6腎癌細(xì)胞生物學(xué)特性的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 萇恩強;HIF-1α、TGF-β1在肺低氧代謝中的表達及作用機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 閆雍容;TGF-β1調(diào)控miR-21參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的研究[D];暨南大學(xué);2011年

3 王超群;Hsa-miR-133a對乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及其機制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

4 李小華;MiR-200家族在人胃癌組織的表達及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

5 朱墨;DNA甲基化異常對miR-615-5p在胰腺癌細(xì)胞株中表達影響的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

6 劉清;食管鱗癌中微小RNA let-7的作用及其對高遷移率蛋白A2的影響[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2011年

7 封麗莎;MicroRNA-21激活肝星狀細(xì)胞的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

8 汪林寶;Let-7a-1前體和K-ras在食管癌中的表達及臨床意義[D];鄭州大學(xué);2011年

9 葉昱坪;miRNAs在乳腺癌中的表達及意義[D];鄭州大學(xué);2011年

10 趙娟芳;新疆哈薩克族食管鱗癌miR-203和miR-34b的表達及意義[D];石河子大學(xué);2011年

本文編號：2370790