【摘要】：p53是維護(hù)基因組穩(wěn)定、參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的主要因子。在內(nèi)外源性損傷或癌基因激活時(shí),p53被激活以應(yīng)答DNA損傷并根據(jù)損傷的嚴(yán)重程度決定細(xì)胞的命運(yùn)。p53能阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程以修復(fù)損傷,對(duì)不可修復(fù)的損傷p53誘導(dǎo)其凋亡。p53是一個(gè)至關(guān)重要的抑癌基因。超過50%的腫瘤有TP53突變。MSCs因其免疫原性低和多潛能分化而被廣泛應(yīng)用于損傷治療,如人的骨、軟骨、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等,以及本課題組將其應(yīng)用于大鼠的脊髓、胰腺和皮膚損傷及肝移植,甚至用于小鼠的輻射損傷。前期研究證實(shí)MSCs可降低輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺瘤的發(fā)生率。雖然人們對(duì)MSCs參與損傷修復(fù)的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究,但詳細(xì)機(jī)制仍然不清楚。因此本研究以p53為切入點(diǎn)從表觀遺傳學(xué)及p53突變和信號(hào)傳遞等方面探討MSCs對(duì)輻射損傷的修復(fù)作用及其機(jī)制。方法:1、小鼠胸腺瘤模型制備選取C57BL/6J小鼠,分為正常組和照射組。根據(jù)Kaplan經(jīng)典方法,用X射線全身照射方法建立胸腺瘤模型,每周照射一次,每次1.75Gy全身照射,劑量率300c Gy/s,共照射4次,總劑量為7Gy。再將照射組分為單純照射組和MSCs干預(yù)的照射組。每天觀察小鼠狀態(tài),6個(gè)月后鑒定胸腺瘤。2、MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定應(yīng)用全骨髓貼壁培養(yǎng)方法分離、純化MSCs。選取C57BL/6J乳鼠,脫臼處死后無菌分離出股骨,去除干骺端,用L-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔。制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105/ml并接種于25cm2底面積的培養(yǎng)瓶中,加入含10%胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)液,放于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后換液去除未貼壁的細(xì)胞,每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,每周換液2次。待細(xì)胞密度達(dá)80%~90%時(shí)傳代。并對(duì)MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化鑒定。取傳至第3代的MSCs細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105/ml并接種于鋪有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,2ml/孔。向培養(yǎng)板內(nèi)加入成骨誘導(dǎo)液(L-DMEM培養(yǎng)液、20%胎牛血清、10mmolβ-甘油磷酸鈉,10mol地塞米松,50μg/m L抗壞血酸)和脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液(10mg/L重組人胰島素、0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、100μmol/L吲哚美辛)培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞變化,2周后進(jìn)行堿性磷酸酶染色和油紅O染色。3、MSCs注射受照射小鼠取細(xì)胞濃度為2×106/ml的MSCs 0.2ml,于第4次照射后當(dāng)天或者第二天尾靜脈注射,一周后第二次注射,共注射2次。4、免疫組化檢測(cè)p53的表達(dá)取石蠟包埋的小鼠胸腺組織,切片,脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加1:300稀釋的兔抗小鼠p53抗體,4℃過夜。PBS洗滌后滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體,室溫孵育20min,滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶,室溫孵育20min。DAB顯色,復(fù)染,梯度乙醇脫水、二甲苯透明,封片。5、RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)量的變化應(yīng)用EASYspin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒提取小鼠胸腺組織RNA,應(yīng)用小鼠p53及相關(guān)基因的特異引物進(jìn)行RT-PCR,反應(yīng)條件為:94℃1 min;94℃30 s,55~65℃30s,72℃30s,30個(gè)循環(huán);72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%~2%的瓊脂糖膠電泳鑒定。6、p53啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)及分析應(yīng)用組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取胸腺基因組DNA,再用EZ DNA Methylation-Gold Kit對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理后,應(yīng)用甲基化特異引物檢測(cè)p53啟動(dòng)子甲基化,并用甲基化測(cè)序引物擴(kuò)增p53啟動(dòng)子、測(cè)序。PCR反應(yīng)條件:94℃1 min;94℃30 s,55~65℃30s,72℃30s,30個(gè)循環(huán);72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖膠電泳鑒定。7、目的基因測(cè)序及分析經(jīng)瓊脂糖膠電泳鑒定正確的PCR產(chǎn)物,應(yīng)用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進(jìn)行回收、純化后,與TA載體p MD18-T連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)氨芐抗性篩選,挑取單克隆擴(kuò)增培養(yǎng),用質(zhì)粒小量快速提取試劑盒提取質(zhì)粒,并用Bam HⅠ(或Eco RⅠ)和HindⅢ雙酶切鑒定,再選取陽性重組質(zhì)粒測(cè)序。對(duì)所測(cè)得的序列經(jīng)BLAST分析,判斷是否是目標(biāo)基因,再應(yīng)用Clustal W軟件比對(duì)分析。結(jié)果:1、小鼠MSCs的培養(yǎng)及鑒定采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)C57BL/6J乳鼠骨髓MSCs,接種48h后,鏡下可見細(xì)胞開始貼壁,體積較小,主要呈圓形;72h后貼壁細(xì)胞開始出現(xiàn)梭型,呈成纖維樣生長(zhǎng);10天左右細(xì)胞密度可達(dá)80%~90%,形態(tài)主要是成纖維樣。經(jīng)傳代后,圓形細(xì)胞逐漸消失,細(xì)胞均呈梭型,似魚群樣或鋪路石樣排列生長(zhǎng)。對(duì)MSCs進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化,結(jié)果顯示,成骨誘導(dǎo)的MSCs堿性磷酸酶染色深,細(xì)胞形成聚集體,未誘導(dǎo)組則沒有。成脂誘導(dǎo)的MSCs胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),脂滴逐漸增多。表明MSCs可誘導(dǎo)分化成骨和脂肪。2、病理學(xué)檢測(cè)分析小鼠胸腺結(jié)構(gòu)解剖X射線照射后6個(gè)月的C57BL/6J小鼠,肉眼觀察可見單純照射組小鼠胸腺明顯大于正常對(duì)照,無胸腺正常結(jié)構(gòu),呈淡黃色;MSCs干預(yù)的照射組小鼠胸腺大小接近正常對(duì)照組,無正常小鼠胸腺的分葉結(jié)構(gòu),顏色介于正常對(duì)照組和單純照射組之間。胸腺組織病理切片后,光鏡下觀察可見對(duì)照組小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)正常,皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,以淋巴細(xì)胞為主,淋巴細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,大小均一,呈圓形或橢圓形。照射組小鼠正常胸腺結(jié)構(gòu)被破壞,未見正常淋巴細(xì)胞,淋巴樣腫瘤細(xì)胞彌漫分布,呈典型的淋巴瘤特征性細(xì)胞,有壞死碎屑,表明輻射誘導(dǎo)胸腺瘤形成。MSCs干預(yù)的照射組可見小鼠胸腺結(jié)構(gòu),淋巴細(xì)胞趨于正常,未見淋巴瘤特征性細(xì)胞。3、MSCs上調(diào)受照射的小鼠胸腺組織p53蛋白和m RNA的表達(dá)量免疫組化和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,單純照射組胸腺瘤組織p53蛋白和m RNA的表達(dá)量高于正常對(duì)照組(t=3.73、p=0.02和t=18.768、p0.001),而MSCs干預(yù)的受照射小鼠未成瘤的胸腺組織p53蛋白和m RNA的表達(dá)量高于單純照射組(t=3.065、p=0.037和t=5.801、p=0.004)。4、分析MSCs影響輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺組織p53啟動(dòng)子甲基化瓊脂糖凝膠電泳顯示正常對(duì)照組、單純照射組、MSCs干預(yù)的照射組均未擴(kuò)增出甲基化條帶。亞硫酸鹽測(cè)序法分析顯示,正常組三例胸腺組織p53啟動(dòng)子均未發(fā)生甲基化。單純照射組三例中有一例發(fā)生甲基化,在第一外顯子+143位點(diǎn)、啟動(dòng)子遠(yuǎn)端-1190位點(diǎn)。這二個(gè)位點(diǎn)不在已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的基序內(nèi)。但是應(yīng)用Matlnspector Professional Database(www.genomatix.de/)分析結(jié)果顯示,-1190位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄因子E2A結(jié)合的基序內(nèi)。MSCs干預(yù)的受照射小鼠未成瘤的胸腺組織三例中有一例發(fā)生甲基化,分別在第一外顯子+198位點(diǎn)、啟動(dòng)子遠(yuǎn)端-1043、-1090、-1158位點(diǎn),其中+198位于轉(zhuǎn)錄因子Pax結(jié)合基序(+195/+201)內(nèi),-1043和-1090分別位于負(fù)調(diào)控區(qū)-1065/-1084兩側(cè)。5、MSCs影響受照射小鼠胸腺p53基因突變根據(jù)C57BL/6J小鼠p53 m RNA的CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增獲得小鼠胸腺p53基因,克隆測(cè)序。每只鼠選取10個(gè)重組質(zhì)粒測(cè)序,將所測(cè)的序列經(jīng)BLAST分析,去除非小鼠p53基因后,轉(zhuǎn)換成氨基酸序列,應(yīng)用Clustal W軟件比對(duì)分析。結(jié)果顯示,單純照射組p53氨基酸突變位點(diǎn)多,同一只鼠的不同克隆的p53突變位點(diǎn)不同,不同鼠的突變位點(diǎn)多數(shù)也不相同,且突變多集中于外顯子4、5、6、7、8,突變率為78%。而MSCs干預(yù)的照射組p53氨基酸突變位點(diǎn)明顯減少,突變率為48%。6、MSCs影響p53信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)(1)MSCs對(duì)p53上游因子的影響RT-PCR檢測(cè)p53上游因子m RNA水平的結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組對(duì)比,單純照射組Chk2的表達(dá)量下降(t=0.317,p=0.767);p53的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子Mdm2的表達(dá)量升高(t=5.514,p=0.005),而其調(diào)節(jié)因子p19也增加(t=2.424,p=0.072)。與單純照射組對(duì)比,MSCs干預(yù)的照射組,Chk2的表達(dá)量明顯減少(t=4.386,p=0.012);p53的抑制因子Mdm2的表達(dá)量顯著下降(t=13.833,p0.001),p19的表達(dá)量下調(diào)(t=1.352,p=0.248)。此外p53的其他調(diào)節(jié)因子如DNMT1經(jīng)照射后其表達(dá)量明顯減少(t=19.356,p0.001),MSCs干預(yù)的照射組其表達(dá)量增加(t=3.302,p=0.030)。(2)MSCs對(duì)p53靶因子的影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組對(duì)比,單純照射組p53重要的靶基因p21 m RNA的表達(dá)量增加(t=0.227,p=0.831),另一調(diào)控細(xì)胞周期的CDC25c m RNA的表達(dá)量也上調(diào)(t=10.505,p0.001);凋亡基因Bax、Fas和損傷修復(fù)基因DDB2的表達(dá)量卻下降(t=5.101、p=0.007,t=0.330、p=0.758和t=4.296、p=0.013),而修復(fù)基因DDIT4、GADD45αm RNA的表達(dá)量增加(t=1.912、p=0.128和t=3.631、p=0.022)。與單純照射組對(duì)比,MSCs干預(yù)的照射組p21和CDC25c m RNA的表達(dá)量減少(t=1.833、p=0.141和t=2.995、p=0.040),而凋亡基因Bax和Fas的m RNA表達(dá)量上調(diào)(t=3.648、p=0.022和t=0.988、p=0.379),修復(fù)蛋白DDB2、DDIT4、GADD45α的m RNA表示量均下調(diào)(t=6.137、p=0.004,t=2.617、p=0.059和t=3.687、p=0.021)。結(jié)論:1、MSCs上調(diào)受照射的小鼠胸腺組織p53蛋白和m RNA的表達(dá)量。2、MSCs可增加輻射損傷小鼠胸腺p53啟動(dòng)子甲基化,影響負(fù)調(diào)控因子的結(jié)合,從而增加p53的表達(dá)。3、MSCs可保護(hù)或修復(fù)輻射造成的p53氨基酸的突變,使突變率由單純照射組的78%下降至48%,使行使正常功能的p53蛋白增多。4、MSCs可下調(diào)Mdm2的表達(dá),減少M(fèi)dm2對(duì)p53的降解,使p53的表達(dá)量增加。5、MSCs通過減少p53靶基因p21、CDC25c m RNA的表達(dá)以解除細(xì)胞周期阻滯。6、MSCs通過下調(diào)p53靶基因DDB2、DDIT4和GADD45α的表達(dá)、上調(diào)p53靶基因Bax和Fas的表達(dá)使不能修復(fù)損傷DNA的細(xì)胞凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R736.3
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本文編號(hào)：2370205