【摘要】：乳腺癌是中國女性所患的惡性腫瘤中發(fā)病率最高的癌癥。目前乳腺癌的綜合治療明顯提高了乳腺癌的臨床療效,但很多病人仍因癌癥的復發(fā)、轉移和治療抵抗而死亡。戰(zhàn)勝乳腺癌,尤其是進展期乳腺癌的最終目標是克服治療抵抗和避免癌癥復發(fā)和轉移。所以尋找乳腺癌的增殖、復發(fā)、轉移及治療抵抗等生物學特征的相關因素和機制成為首要任務。乳腺癌干細胞(BCSCs)是乳腺腫瘤中的一部分細胞群,具有干細胞特性,如自我更新、高度增殖和多向分化等。大量證據表明BCSCs是癌癥復發(fā)、轉移和治療抵抗的原因。各種干細胞相關通路調控BCSCs的生物學功能。其中最主要的Wnt/β-catenin在乳腺癌組織,尤其在BCSCs中異�；罨�,能啟動多種與乳腺癌起始、發(fā)展相關基因的表達,且是維持BCSCs增殖的關鍵因素。β-catenin是調節(jié)細胞附著或脫離的細胞動力學粘著連接的一個重要組成部分,既是Wnt信號通路的主要調控因子,又是細胞間聯系的一種接合蛋白。實驗證明誘導Wnt-l及β-catenin的高表達能提高小鼠乳腺腫瘤中BCSCs的比例。已發(fā)現β-catenin和其下游目標基因如cyclin D1和c-my在乳腺癌中異常表達。因此,特異性阻斷BCSCs中Wnt/β-catenin和其相關基因對治療乳腺癌具有重要價值。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是長度約22 nt的內源性短鏈RNA,可通過與目標m RNA的3’UTR互補結合后調節(jié)靶基因的翻譯和表達。所以,micro RNA和編碼結構性和調節(jié)性蛋白的目標m RNA所組成的復雜網絡,調控個體發(fā)育、細胞分化、細胞增殖及凋亡以及腫瘤的形成。鑒于Wnt/β-catenin是BCSCs的重要調控途徑,目前已發(fā)現一些micro RNA可通過抑制β-catenin的表達,調控Wnt/β-catenin活性,進而調節(jié)BCSCs。目前尚未見mi R-1對BCSCs中Wnt/β-catenin的調控研究。鑒于此,本課題研究mi R-1通過調控Wnt/β-catenin,影響B(tài)CSCs干細胞特性的作用機制以及乳腺癌相關基因與乳腺癌生物學行為的關系。具體工作如下:本實驗首先通過mi RNA基因芯片研究了BCSCs和非CSC腫瘤細胞中與VI Wnt/β-catenin相關的mi RNA表達譜,得出相比于非CSC腫瘤細胞,在BCSCs中有14個mi RNAs表達上調,13個mi RNAs表達下調。其中mi R-1在BCSCs中低表達。然后通過定量RT-PCR分析了mi R-1在不同亞型乳腺癌組織及血清樣本中的表達情況,發(fā)現mi R-1表達與乳腺癌的侵襲力呈負相關。為了進一步研究mi R-1在BCSCs的功能,我們在MCF-7和SKBR3細胞和其中分選出的CSCs中轉染mi R-1mimic和mi R-1inhibitor,增強或抑制mi R-1的表達。流式細胞儀分析發(fā)現MCF-7和SKBR3細胞中,增強mi R-1的表達降低了SKBR3/CSCs的百分比,抑制mi R-1的表達增加了MCF-7/CSCs的百分比,可見mi R-1的過表達降低了乳腺癌細胞系中CSC的比例。mi R-1在Wnt/β-catenin中的可能目標用生物信息分析和熒光素酶分析明確。雙熒光素酶報告基因檢測和western blot結果表明,增強mi R-1的表達明顯減少了293T細胞中Frizzled 7、TNKS2(Tankyrase-2)調控的熒光素酶活性,并降低了體外BCSCs中Frizzled7,TNKS2,c-Myc,Oct4(Octamer Binding Transcription Factor 4)和Nanog的表達,同時降低了β-catenin的核質比和β-catenin-依賴的螢光素活性,明確了mi R-1抑制Wnt/β-catenin,從而降低BCSCs的干細胞性。細胞增殖和遷移實驗明確mi R-1抑制體外乳腺腫瘤干細胞的增殖,遷移能力。移植瘤乳腺癌模型顯示增強mi R-1的表達抑制了植入MCF-7/CSCs的生長,而抑制mi R-1的表達促進了體內植入MCF-7/CSCs的生長。這些數據(實驗研究1.1)表明,mi R-1通過靶向Frizzled 7及TNKS2抑制了Wnt/β-catenin,從而下調了BCSCs的干細胞性、增殖和遷移。鑒于BCSCs是乳腺癌發(fā)生,復發(fā)和轉移的根源,基于mi R-1的阻斷療法有望在預防和阻斷乳腺癌的復發(fā)和轉移中起到重要作用。我們進一步研究了Wnt/β-catenin關鍵因子β-catenin、cyclin D1、c-myc表達與乳腺癌生物學行為的相關性(實驗研究1.2)。發(fā)現乳腺癌組的β-catenin異常表達率、cyclin D1和c-myc陽性表達率均明顯高于乳腺增生組的對應指標。淋巴結轉移與cyclin D1、c-myc的表達有關。乳腺癌β-catenin異常表達,與cyclin D1和c-myc陽性表達有相關。Western blot檢測方法明確與乳腺癌增生組織相比,乳腺癌組織、乳腺癌細胞質和細胞核中的β-catenin表達水平明顯升高,乳腺癌組織細胞核中β-catenin的蛋白水平高于細胞質。這些數據提示乳腺癌的發(fā)生可能與β-catenin異常表達,cyclin D1和c-myc陽性表達有關,并且cyclin D1、c-myc可能被β-catenin激活。Lipase member H蛋白與Wnt/β-catenin一樣是重要的腫瘤調控因素。在人類中Lipase member H蛋白是LIPH基因編碼的酶,參與多種生物學過程,包括血小板凝集,平滑肌收縮,細胞增殖的刺激。雖現有研究發(fā)現LIPH m RNA在腸、肺和胰腺特異性表達,但在乳腺癌中的表達尚不明確。我們研究了Lipase member H與乳腺癌生物學行為的關系(實驗研究1.3),尋找阻斷乳腺癌增殖的新靶點。發(fā)現與癌旁組織相比,乳腺癌組織高表達Lipase member H蛋白,明顯相關于組織學分級,淋巴結轉移和術后遠處轉移。進一步分析后Lipase member H蛋白的表達被認定為是乳腺癌的獨立預后因子。表明Lipase member H蛋白的表達是不良預后預測因素,Lipase member H蛋白有望成為乳腺癌的治療目標。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2369761