【摘要】：研究目的：食管鱗癌是一種常見的預(yù)后較差的胃腸道惡性腫瘤,盡管目前手術(shù)、放療及化療等手段不斷改進(jìn),食管鱗癌患者的5年生存率仍不足30%。食管鱗癌預(yù)后主要與腫瘤侵犯的深度、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否等有明顯相關(guān)性。除了這些臨床病理因素外,目前用于預(yù)測食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)記物研究也取得了很大進(jìn)展,食管癌分子標(biāo)記物可以進(jìn)行食管癌早期檢測或者區(qū)分食管鱗癌高風(fēng)險(xiǎn)及低風(fēng)險(xiǎn)病人以得到最佳治療。PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)又名TEP1或者M(jìn)MAC1,位于染色體10q23.3, PTEN蛋白的脂類磷酸酶活性主要作用機(jī)制是可將3,4,5-三磷酸鹽(PIP3)去磷酸化形成4,5-二磷酸鹽(PIP2),進(jìn)而抑制PIP3與PDK1/Akt的絲蘇氨酸位點(diǎn)結(jié)合,此作用導(dǎo)致了Akt及其下游通路的激活受抑制。PTEN蛋白通過此拮抗PI3K/Akt信號通路而起到了腫瘤抑制作用,因此其被認(rèn)為是重要的抑癌基因。目前很多研究表明PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)與前列腺癌、乳腺癌及腦惡性膠質(zhì)瘤等有明顯相關(guān)性,但是PTEN在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系研究仍存在矛盾的結(jié)論,仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)其相關(guān)性。除此之外,PTEN失表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)關(guān)系目前仍無任何報(bào)道。PTEN基因啟動(dòng)子上具有富含CpG島的區(qū)域,為DNA甲基化提供了一種可能。目前多項(xiàng)研究表明PTEN啟動(dòng)子的甲基化與多種腫瘤組織中的PTEN蛋白低表達(dá)有明顯相關(guān)性,例如低分化的腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤及肺癌等中均發(fā)現(xiàn)PTEN啟動(dòng)子甲基化是參與PTEN表達(dá)降低的一種機(jī)制。但是目前關(guān)于PTEN甲基化在食管鱗癌中的報(bào)道較少,僅有Pan研究了哈薩克斯坦族的食管鱗癌病人的甲基化情況,其發(fā)現(xiàn)PTEN甲基化水平在食管鱗癌病人(中位甲基化率10%)中明顯高于正常人(中位甲基化率6.0%),男性食管鱗癌病人的PTEN甲基化水平明顯高于女性,同時(shí)PTEN甲基化水平與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度有關(guān)(p0.05),但是目前仍無食管鱗癌中PTEN甲基化與PTEN表達(dá)水平相關(guān)性的研究。針對以上仍未解決的問題,本論文旨在探討并明確食管鱗癌中PTEN的表達(dá)情況及其與食管鱗癌患者預(yù)后、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及PTEN啟動(dòng)子甲基化之間的相關(guān)性。研究方法：本研究主要納入了2006年1月-2007年12月期間在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胸外科行胸中段食管鱗癌切除的74例患者。利用免疫組化及實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)測定了食管鱗癌及癌旁正常食管上皮PTEN的表達(dá)情況(蛋白及mRNA水平),研究了食管鱗癌中PTEN蛋白表達(dá)情況與各臨床病理因素的相關(guān)性,評估了PTEN蛋白陰性表達(dá)與食管鱗癌患者生存率及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。為了驗(yàn)證我們的臨床結(jié)論,我們以慢病毒為載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞系(Eca109),以穩(wěn)定抑制PTEN的表達(dá)水平。然后分析不同處理組的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)的變化情況；同時(shí)我們將不同處理組的食管鱗癌細(xì)胞系注射入裸鼠皮下組織中形成移植瘤生長模型,分析觀察了不同組中裸鼠移植瘤的生長速度變化情況。我們還利用Western Blot研究了可能參與PTEN作用的下游指標(biāo)(FAK及p-FAK)的表達(dá)變化情況。在甲基化研究方面,我們利用甲基化特異性PCR(MSP)分析了74例食管鱗癌樣本及四種食管鱗癌細(xì)胞系中的PTEN甲基化情況,檢測了PTEN甲基化在食管鱗癌患者預(yù)后及各臨床病理因素中的關(guān)系。在臨床樣本水平,我們對PTEN的甲基化狀態(tài)及其與PTEN表達(dá)情況的關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)分析；同時(shí)在食管鱗癌細(xì)胞系水平,我們還利用5-氮雜胞苷處理PTEN甲基化陽性的食管鱗癌細(xì)胞系(Eca9706),分析了經(jīng)5-氮雜胞苷處理后PTEN表達(dá)情況的變化及甲基化狀態(tài)的變化情況。結(jié)果：食管鱗癌組織中的PTEN mRNA水平明顯低于癌旁正常食管上皮組織(p0.001),41例(55.4%)的食管鱗癌組織呈PTEN mRNA低表達(dá)(相比于癌旁正常食管上皮),38例(51.4%)的食管鱗癌組織呈PTEN蛋白陰性表達(dá)；臨床病理因素分析中,PTEN蛋白陰性表達(dá)與腫瘤的侵犯深度(T分期)及淋巴結(jié)侵犯情況(N分期)有明顯相關(guān)性(p=0.005及p=0.021)；單因素分析表明PTEN蛋白陰性表達(dá)與患者5年生存率及3年淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率明顯相關(guān)(p=0.001及p=0.019),但多因素回歸分析表明PTEN蛋白陰性表達(dá)并不是食管鱗癌患者5年生存率及3年淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率的獨(dú)立預(yù)后因素(p0.05)；慢病毒穩(wěn)定抑制PTEN表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞系相比于陰性對照組細(xì)胞系的細(xì)胞增殖速度、細(xì)胞遷徙、細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)(p0.05),裸鼠體內(nèi)移植瘤生長實(shí)驗(yàn)表明穩(wěn)定抑制PTEN表達(dá)后移植瘤的生長速度明顯增強(qiáng)(p0.05)。機(jī)制研究方面,Western Blot提示不同處理組中FAK及p-FAK均無明顯表達(dá)變化,表明FAK及p-FAK不是參與PTEN機(jī)制的主要指標(biāo),可能其他通路或者因子參與PTEN在食管鱗癌中的作用機(jī)制,仍需進(jìn)一步研究明確。甲基化研究方面,僅有14例(18.9%)的食管鱗癌組織及1例食管鱗癌細(xì)胞系(EC9706)存在PTEN啟動(dòng)子的甲基化；PTEN甲基化與各臨床病理因素及臨床預(yù)后無明顯相關(guān)性；詳細(xì)分析PTEN甲基化狀態(tài)及PTEN mRNA/蛋白的關(guān)系發(fā)現(xiàn)PTEN甲基化是PTEN失表達(dá)(mRNA及蛋白水平)的一種可能機(jī)制,經(jīng)5-氮雜胞苷處理后,PTEN的甲基化狀態(tài)被逆轉(zhuǎn),且PTEN的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高,此在細(xì)胞水平上證實(shí)了PTEN甲基化與PTEN表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)論及意義：食管鱗癌組織中存在PTEN的低表達(dá)情況且比較普遍；盡管PTEN蛋白陰性表達(dá)不是患者生存率及淋巴結(jié)復(fù)發(fā)率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但是PTEN蛋白陰性表達(dá)與食管鱗癌患者生存率及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率有明顯相關(guān)性,未來PTEN蛋白陰性表達(dá)可能作為預(yù)測食管鱗癌預(yù)后的一種有效的分子標(biāo)記物；臨床分析及細(xì)胞試驗(yàn)均表明食管鱗癌中PTEN甲基化是PTEN低表達(dá)的一種可能機(jī)制,但是因?yàn)镻TEN啟動(dòng)子甲基化率在食管鱗癌中比較低,其可能不是食管鱗癌中導(dǎo)致PTEN低表達(dá)的主要機(jī)制,可能其他的一些機(jī)制,如轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)或者翻譯水平調(diào)節(jié)等是導(dǎo)致PTEN低表達(dá)的主要機(jī)制,其仍需進(jìn)一步的研究進(jìn)行證實(shí)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2367144