【摘要】：研究背景肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinama,HCC)是全球范圍內(nèi)對人們的健康威脅最大的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危害著人們的健康[1]。每年原發(fā)性肝癌的發(fā)病率在惡性腫瘤發(fā)病率中排第5位,男性病死率更是居于第2位[2]。在世界范圍內(nèi),每年的增加的肝癌患者中,男性患者為530,000例,女性患者為230,000例,分別在癌癥位增加率的第4位和第8位,而每年由于肝癌而死亡的人群中男性為460,000例,女性為211,600例[3]。過去10年中,我國的原發(fā)性肝癌的發(fā)病率持續(xù)升高,且速度驚人。隨著社會的快速發(fā)展,人口結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生了巨大的改變,在城市,尤其是大中型城市,原發(fā)性肝癌已經(jīng)位列惡性腫瘤死亡率第2位。盡管隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展以及人們對HCC認(rèn)識的不斷深入,如肝移植,手術(shù)切除等等,但原發(fā)性肝癌患者的3年生存率仍未明顯提高。就目前來說,如何早期診斷以及控制術(shù)后復(fù)發(fā)的仍是HCC研究的重中之重�，F(xiàn)以證實肝癌是由于一系列分子和信號通路紊亂而造成的。因此,找到有效的作用靶點和探索肝癌的發(fā)生機(jī)制已成為治療原發(fā)性肝癌的重點和難點。肝臟在代謝、解毒和排泄等方面發(fā)揮重要作用,當(dāng)發(fā)生肝癌,肝硬化時,機(jī)體內(nèi)正常的生理反應(yīng)會受到影響。血氨在臨床工作中具有重要意義,可用于肝性腦病的診斷和鑒別,正常人血氨為18~72μmol/L。正常人體內(nèi)的氨主要在肝臟中合成尿素,然后經(jīng)腎臟排除體外[4]。在腦、心肌和骨骼肌等組織中,谷氨與谷氨酸在氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的作用下,生成谷氨酰胺,后經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)運至肝臟中,谷氨酰胺在谷氨酰胺酶(glutaminase)的作用下重新生成氨,最后合成尿素[5]。尿素循環(huán)(urea cycle)是哺乳動物代謝氨一個途徑。首先,在肝細(xì)胞的胞漿中,氨基酸與α-酮戊二酸通過轉(zhuǎn)氨基作用生成谷氨酸,并進(jìn)入線粒體基質(zhì),經(jīng)谷氨酸脫氫酶催化后生成的一分子的氨[6];然后,氨基甲酰合成酶I催化游離的氨與CO2、2分子ATP,生成氨基甲酰磷酸,氨基甲酰磷酸在鳥氨酸轉(zhuǎn)氨基轉(zhuǎn)移的催化下生成瓜氨酸[7];隨后,瓜氨酸進(jìn)入肝細(xì)胞胞漿,在精氨酸代琥珀酸合成酶的催化下,與天冬氨酸縮合成,并消耗一分子ATP,天冬氨酸在反應(yīng)中充當(dāng)氨基供體[8];最后,精氨酸代琥珀酸裂解生成精氨酸和延胡索酸,而精氨酸被精氨酸酶的催化水解,生成尿素與鳥氨酸[9]。精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase,ASS),是一種催化瓜氨酸及天冬氨酸催生成精氨基琥珀酸的酶,反應(yīng)需要ATP供能,它是尿素循環(huán)中重要的限速酶[10]。目的本研究擬采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將shRNA-ASS1轉(zhuǎn)入SMMC-7721細(xì)胞中,沉默ASS1基因,觀察ASS1基因沉默后SMMC-7721細(xì)胞的增殖與凋亡情況及其可能的作用機(jī)制。材料與方法1.采用Real-time PCR和Western Blot法檢測ASS1mRNA和蛋白在Changliver、SMMC-7721、HepG2、HepG3B和QGY-7703細(xì)胞中表達(dá)差異。2.運用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將shRNA-ASS1轉(zhuǎn)入SMMC-7721細(xì)胞中,Real-time PCR和Western Blot法檢測ASS1mRNA和蛋白的表達(dá)情況。3.CCK-8法檢測shRNA-ASS1對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響情況4.流式細(xì)胞術(shù)檢測shRNA-ASS1對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響情況5.Western Blot法檢測shRNA-ASS1對Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)的影響。6.采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,兩組數(shù)據(jù)間的比較采用student’s-t檢驗,多組數(shù)據(jù)間的比較用單因素方差分析,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.與Changliver細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和QGY-7703細(xì)胞相比ASS1 mRNA和蛋白在SMMC-7721細(xì)胞和HepG3B細(xì)胞中呈高表達(dá)。ASS1 mRNA在SMMC-7721細(xì)胞和HepG3B細(xì)胞中的相對表達(dá)量明顯高于其他細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);ASS1蛋白在SMMC-7721細(xì)胞和HepG3B細(xì)胞中表達(dá)量高于其他細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.shRNA-ASS1轉(zhuǎn)染組SMMC-7721細(xì)胞較空白對照組SMMC-7721細(xì)胞相比,ASS1蛋白水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組SMMC-7721細(xì)胞空白對照組細(xì)胞相比,ASS1蛋白水平無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。這表明shRNA-ASS1明顯移至SMMC-7721中ASS1基因的表達(dá)。3.CCK-8結(jié)果顯示,與空白對照組和陰性對照組相比,shRNA-ASS1細(xì)胞生長受到明顯抑制,并與Mock組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),Mock組和NC組細(xì)胞生長無明顯差別(P0.05)。4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,空白對照、陰性對照組及shRNA-ASS1組凋亡率分別為(0.3±0.12)%,(3.0±1.08)%和(27.1±3.52)%;與空白對照組相比,shRNA-ASS1組細(xì)胞凋亡率明顯上升并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),空白對照組和陰性對照組細(xì)胞生長無明顯差別(P0.05)。5.轉(zhuǎn)染shRNA-ASS1 72h后,ASS-1 shRNA較空白對照組組相比Bax、Cleaved Caspase-3的表達(dá)較對照組上調(diào)(P0.05),bcl-2、的表達(dá)較對照組下調(diào)(P0.05),空白對照組和陰性對照組細(xì)胞生長無明顯差別(P0.05)。結(jié)論1.靶向ASS1基因的RNA干擾能夠抑制SMMC 7721細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,且這種凋亡依賴于caspase家族的激活。2.ASS1基因具有作為治療原發(fā)性肝癌靶點的潛在價值。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 郝繼輝;俞鳴;賈麗;柳鳳亭;李強(qiáng);郝希山;;凋亡蛋白Bax在腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)惡性淋巴瘤細(xì)胞耐藥中的調(diào)節(jié)作用[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年02期

2 馮鉅濤,劉銀坤,代智,周海軍,宋海燕,欽倫秀,金紅,陸豪杰,湯釗猷;血清蛋白質(zhì)組分析技術(shù)篩選肝癌自發(fā)抗體[J];中華肝臟病雜志;2005年11期

3 楊秉輝,夏景林,黃力文,湯釗猷,陳敏山,李錦清,梁安民,莫欽國,盧輝山,戴朝六,嚴(yán)律南,于志堅,饒榮生,黎樂群,蘇智雄,方壯偉;我國肝癌“臨床相”30年的變遷——原發(fā)性肝癌3250例的對比研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2003年12期

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本文編號：2357828