【摘要】：研究背景和目的原發(fā)性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma, HCC)是我國最常見的并且是惡性程度最高的惡性腫瘤之一,是一種對人民健康產生嚴重威脅的惡性腫瘤。原發(fā)性肝細胞癌在亞洲具有有很高的發(fā)病率和死亡率。然而,最近晚期肝癌1年存活率仍不到50%。經導管肝動脈化學栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)為肝癌非手術治療的重要方法之一,經股動脈插入導管,將導管超選擇地插入肝固有動脈或腫瘤供血分支,然后經導管注入栓塞劑和治療藥物,采用TACE可提高腫瘤局部的藥物濃度,從而提高療效,減少全身副作用。目前,TACE不僅作為不能切除肝癌的主要治療手段,而且能應用于可切除的肝癌,有門脈癌栓肝癌,惡性肝轉移瘤的治療。放射治療是通過發(fā)射高能的射線破壞腫瘤區(qū)域的細胞DNA,造成細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞。放射治療作為肝癌綜合治療的重要手段,主要適用于不能手術切除的患者,可以治療肝臟腫瘤及遠處轉移灶,但近年來由于放療技術的發(fā)展,肝癌的放射治療應用逐漸增多。三維適形放療及調強放療是采用三維適形治療或調強計劃系統(tǒng)進行聚焦式照射,達到精確定位、精確計算和精確治療。正常肝臟對輻射較敏感,肝癌腫瘤與低分化鱗癌有相似的放射敏感性,其放射敏感性在人體中僅次于骨髓、淋巴組織和腎臟。VX2瘤株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌,在兔動物體內缺乏該腫瘤的抗體,可接種到動物兔肝臟、腎臟、肌肉、肺臟等部位,制成兔原位腫瘤動物模型。VX2兔肝腫瘤具有與人肝臟富血供腫瘤類似的血供特點,動脈血供豐富,它是在大型動物上建立的富血供肝腫瘤模型,是一種良好的肝腫瘤動物模型。VX2兔肝腫瘤適合行動脈化療栓塞術、影像學、治療學、抗腫瘤藥物的代謝動力學的實驗性研究。侵襲、轉移是腫瘤惡性行為的最本質特征。細胞外基質(extracellularmatrix, ECM)是腫瘤細胞進行侵襲和遷移的第一道重要屏障。腫瘤細胞轉移是一個極其復雜的過程,包括細胞粘附到ECM,蛋白酶分泌,ECM降解和腫瘤細胞遷移,其中重要的第一步是腫瘤細胞通過宿主細胞和ECM的屏障,穿越組織的邊界。細胞分泌的蛋白酶比如纖溶酶原激活劑、絲氨酸蛋白酶、基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases, MMPs)幫助腫瘤細胞實現(xiàn)這遷移過程。MMPs是一類分解細胞外基質、基底膜,與腫瘤的侵襲轉移關系十分密切的蛋白水解酶。目前許多研究證明,MMPs的過度表達與腫瘤的浸潤和轉移相關。在MMPs家族中,MMP-2 (72 kD gelatinase A)和MMP-9 (92 kD gelatinase B)是兩個關鍵的成員,被認為在肝細胞癌侵襲、轉移過程降解基質扮演著重要的角色。MMP-2、 MMP-9能降解層粘連蛋白、巢蛋白、明膠,MMP2還激活MMP-9、MMP-13,能降解I型膠原,MMPs共同作用可降解所有的細胞外基質。肝癌細胞的浸潤和轉移的過程中,必需發(fā)生其基底膜(basementmembrane, BM)的降解,BM呈厚實的網狀結構,主要由糖蛋白、Ⅳ型膠原等組成,而Ⅳ型膠原又是BM的主要支架。豐富的資料研究表明,腫瘤細胞分泌的MMPs中的MMP-2、MMP-9其降解底物是Ⅳ膠原,使BM發(fā)生缺損,促使腫瘤細胞向周圍組織浸潤和轉移。惡性腫瘤組織中MMP-2、MMP-9均有表達,尤其在腫瘤邊緣表達最強,而癌周間質等癌旁正常組織卻為弱表達或不表達。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進肝癌細胞浸潤和轉移的機制主要有：(1)增加血管的通透性；(2)促進血管內皮細胞的增殖；(3)促進血管支持物的生成；(4)抑制腫瘤細胞的調亡；(5)激活了PI3K/AKT、FAK/paxillin、Shc/RAS/MAPK及PLC-IP3/DAG-PKC等信號傳導通路；從而為惡性腫瘤的浸潤、轉移創(chuàng)造條件。既往的研究表明：放療可能對腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達有上調作用,MMP-2、MMP-9是促進腫瘤侵襲中的重要因素,推測放療引發(fā)促進轉移的重要機制之一或是上調了MMPs的表達,增強了它們的活性。輻射能激活了VEGF-MMP2通路,誘導P53的上調,使受照射的肝癌細胞和未受照射的肝癌細胞都增強了侵襲能力。通過PI3K/PTEN/AKT/mTOR途徑,肝癌的侵襲和轉移和MMP9的上調有關。既往研究發(fā)現(xiàn),阻塞小鼠肝臟的動脈血流能引起短暫的血液灌注減少和轉移相關的VEGF和MMP的基因的表達,血流灌注的減少和低氧可能引起VEGF表達的上調。在數(shù)個碘油栓塞治療兔VX2肝癌的實驗中,殘留的癌細胞會出現(xiàn)了MMP-2、MMP-9及VEGF的高表達。有相當部分HCC患者會出現(xiàn)VEGF過表達,VEGF的表達與P53的表達及腫瘤復發(fā)率顯著相關。TACE后殘留的肝癌組織有豐富的血供,增加了VEGF的表達�？傊�,亞致死劑量放射線輻照肝癌細胞后會導致MMP-2、MMP-9、VEGF表達增強,與腫瘤進展和不良預后有關。肝動脈栓塞／阻塞治療動物的肝腫瘤動物模型的實驗中,亦出現(xiàn)了腫瘤區(qū)的MMP-2、MMP-9、VEGF的表達有升高。本研究在建立兔VX2肝癌模型的基礎上,探討VX2兔肝腫瘤放療、兔肝碘油介入栓塞治療和放療聯(lián)合介入治療,對VX2兔肝腫瘤MMP-2、MMP-9、VEGF表達的影響。方法1.實驗性動物模型制備將液氮內凍存VX2瘤株37。C水浴箱內復蘇后,取細胞懸液置傳代培養(yǎng),臺盼藍染色后計算出細胞活率,按1×107/ml活細胞密度調制培養(yǎng)液。于兔后腿外側肌肉內接種0.5m1培養(yǎng)液,兔后腿外側肌肉內2周后產生一個約1cm3實質性的腫物,證明荷瘤兔已經制作成功。在2-4周左右進行傳代,用25mg/kg1%戊巴比妥鈉耳源靜脈麻醉,在無菌條件下手術取出荷瘤兔后腿肌肉內種植的腫瘤,剖開瘤體后取灰白色質硬脆的瘤細胞生長活躍的組織部分,制成約1mm×1mm ×1mm大小的腫瘤組織塊備用。將實驗大白兔麻醉后,鋪無菌巾,無菌條件下逐層開腹,暴露肝臟,以眼科剪于肝左中央葉表面剪開肝組織并形成開口小“燒瓶”樣竇道,在實驗兔肝內,直接植入2-3塊已制作好的1mm3左右的瘤塊,并以小塊的明膠海綿填塞封閉竇口。仔細檢查無活動性出血后回納復位肝臟,逐層關閉腹腔、縫合皮膚。接種2-3周后用二維超聲檢測瘤體至1.5 cm左右時,可供以下實驗使用。2.動物分組隨機將實驗大白兔分成A、B、C、D四組,每組10只。使用碘油1ml對每只兔肝VX2移植瘤進行栓塞治療。A組為對照組；B組為單純碘油栓塞；C為單純放療組；D組為先碘油栓塞介入治療后聯(lián)合放療組；A、B、D組接種2-3周后進行介入治療,C組接種2-3周后進行放射治療,D組介入治療后1周后進行放射治療。實驗大白兔完成治療后1周處死,取出肝臟標本。3.放射治療接受放療的模型兔經將大白兔用25 mg/kg 1%戊巴比妥鈉耳源靜脈麻醉后,在木板體模上固定四肢及頭部,大白兔身上安裝定位標記,CT掃描范圍自胸廓至整個腹部水平,層厚2.5 mm,通過數(shù)字顯示屏查看腫瘤種植的肝臟部位。在大白兔耳源靜脈注入碘帕醇10 ml,再次CT掃描。掃描后的CT圖像通過數(shù)字化形式的局域網傳輸?shù)饺S適形治療計劃系統(tǒng),對圖像進行三維重建后采用三維治療(Three dimensional conformal RT,3D-CRT)計劃系統(tǒng)設計放射治療計劃。放射治療計劃在三維治療計劃系統(tǒng)中設計,大體腫瘤體積(GTV)加上8 mm擺位誤差和腫瘤的運動范圍,成為計劃照射體積(PTV)。勾畫體表輪廓和正常肝組織等重要臟器。劑量參考點位于腫瘤內,經劑量體積直方圖(dose volume histogram, DVH)和等劑量線參考綜合評價優(yōu)化治療計劃,90%的等劑量曲線覆蓋PTV。選擇瓦里安直線加速器(23EX, Varian Medical Systmes, Palo Alto,USA, dose rate of 4Gy/min)放療,6MeV或9MeV電子線,處方劑量為單次劑量15Gy。4.介入治療將實驗兔全麻后,腹部朝上,固定于手術臺上,備皮、常規(guī)手術范圍消毒、鋪無菌巾。根據(jù)腹股溝區(qū)血管走向觸摸股動脈搏動,確定股動脈位置,縱行切開皮膚,暴露出兔股動脈鞘,股動脈鞘內可見并行排列的股靜脈、股動脈和股神經,直徑由粗到細。把股動脈從股神經與股靜脈中鈍性分離出3cm,用4號手術絲線各1根分別穿上已經分離的股動脈近段和遠段,結扎遠端并提起近段,于暴露的股動脈中間段用眼科剪剪開一斜行切口,見有鮮紅色血液噴出,將導管鞘經切口緩緩插人股動脈近端,動脈外留管鞘2厘米,用近端絲線將管鞘與股動脈固定,置入3F微導管和導絲。導管經股動脈、髂動脈進入腹主動脈,第一腰椎水平主動脈處注入造影劑,了解肝動脈走行及腹腔動脈開口位置。沿著微導管置入“J”型導絲于T12-L1之間,導絲頭端朝前,如已到達腹腔動脈開口,導絲會頭端形態(tài)改變或直接嵌入開口,導管探入腹腔干,注入造影劑,繼續(xù)跟進導絲達肝總動脈處,再次注入造影劑,觀察肝動脈走行顯示腫瘤血供情況,根據(jù)造影情況進行腫瘤血供動脈的超選擇插管。行DSA造影檢查后分別注入藥物進行介入治療。5. MMPs和VEGF在VX2兔肝腫瘤的表達研究切取后的腫瘤組織經HE染色,光學顯微鏡觀察。應用免疫組織化學、定量PCR、Western blotting檢測MMP-2,9和VEGF表達水平。統(tǒng)計學處理應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示, 兩組間比較采用獨立樣本Bonferroni檢驗；單因素多組間比較,采用單因素方差分析(one-way ANOVA);以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.VX2兔肝腫瘤組織經HE染色后光學顯微鏡觀察到：未經治療的腫瘤組織內包括光亮和較大細胞核VX2細胞,在各治療組中均可見存活的VX2細胞,炎癥細胞浸潤和壞死。壞死區(qū)域和未經治療的腫瘤組織不一樣,質地較硬,顏色蒼白。經過放射治療,具有活性的腫瘤細胞的數(shù)量減少,部分VX2細胞被纖維組織取代。經肝動脈導管碘油栓塞后,碘油主要是沉積在腫瘤的邊緣,只有少數(shù)碘油進入缺乏血管的腫瘤中央地區(qū)。2.免疫組織化學染色顯示,VEGF、MMP-2和MMP-9均在各組的腫瘤組織中表達。他們主要表達于腫瘤細胞的細胞質中。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),行VEGF, MMP-2和MMP-9蛋白的定量評估,選取陽性區(qū)域測定灰度值。在B、C和D組中,VEGF、MMP-2和MMP-9相比A組顯著增加(p0.05)。然而,VEGF和MMP-2、9的含量在B、C和D組之間沒有顯著差異(p0.05)。免疫印跡分析(Western-blot)也用于檢鋇VEGF、MMP-2、MMP-9的表達,B、C和D組VEGF、MMP-2和MMP-9的表達對比A組也有所增加。我們通過實時PCR比較了殘余腫瘤細胞中VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA轉錄水平,根據(jù)比較Ct值定量實時PCR的結果,治療組(B、C、D組)和A組之間比較：VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA轉錄水平差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),但B、C和D組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論VEGF、MMP-2和MMP-9在殘留的腫瘤細胞的表達：介入組、放療組和介入加放療組與對照組相比有明顯增加,介入加放療組中VEGF、MMP-2和MMP-9的表達對比單一治療組(介入組、放療組)略減少,然而各治療組間沒有明顯差異。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 Walter J.Curran;George Iliakis;;DNA-PKcs subunits in radiosensitization by hyperthermia on hepatocellular carcinoma hepG_2 cell line[J];World Journal of Gastroenterology;2002年05期

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本文編號：2357778