【摘要】：研究背景和目的原發(fā)性肝細(xì)胞癌(primary hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)最常見的并且是惡性程度最高的惡性腫瘤之一,是一種對(duì)人民健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅的惡性腫瘤。原發(fā)性肝細(xì)胞癌在亞洲具有有很高的發(fā)病率和死亡率。然而,最近晚期肝癌1年存活率仍不到50%。經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化學(xué)栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)為肝癌非手術(shù)治療的重要方法之一,經(jīng)股動(dòng)脈插入導(dǎo)管,將導(dǎo)管超選擇地插入肝固有動(dòng)脈或腫瘤供血分支,然后經(jīng)導(dǎo)管注入栓塞劑和治療藥物,采用TACE可提高腫瘤局部的藥物濃度,從而提高療效,減少全身副作用。目前,TACE不僅作為不能切除肝癌的主要治療手段,而且能應(yīng)用于可切除的肝癌,有門脈癌栓肝癌,惡性肝轉(zhuǎn)移瘤的治療。放射治療是通過發(fā)射高能的射線破壞腫瘤區(qū)域的細(xì)胞DNA,造成細(xì)胞凋亡來殺傷腫瘤細(xì)胞。放射治療作為肝癌綜合治療的重要手段,主要適用于不能手術(shù)切除的患者,可以治療肝臟腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶,但近年來由于放療技術(shù)的發(fā)展,肝癌的放射治療應(yīng)用逐漸增多。三維適形放療及調(diào)強(qiáng)放療是采用三維適形治療或調(diào)強(qiáng)計(jì)劃系統(tǒng)進(jìn)行聚焦式照射,達(dá)到精確定位、精確計(jì)算和精確治療。正常肝臟對(duì)輻射較敏感,肝癌腫瘤與低分化鱗癌有相似的放射敏感性,其放射敏感性在人體中僅次于骨髓、淋巴組織和腎臟。VX2瘤株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌,在兔動(dòng)物體內(nèi)缺乏該腫瘤的抗體,可接種到動(dòng)物兔肝臟、腎臟、肌肉、肺臟等部位,制成兔原位腫瘤動(dòng)物模型。VX2兔肝腫瘤具有與人肝臟富血供腫瘤類似的血供特點(diǎn),動(dòng)脈血供豐富,它是在大型動(dòng)物上建立的富血供肝腫瘤模型,是一種良好的肝腫瘤動(dòng)物模型。VX2兔肝腫瘤適合行動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、影像學(xué)、治療學(xué)、抗腫瘤藥物的代謝動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)性研究。侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性行為的最本質(zhì)特征。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行侵襲和遷移的第一道重要屏障。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,包括細(xì)胞粘附到ECM,蛋白酶分泌,ECM降解和腫瘤細(xì)胞遷移,其中重要的第一步是腫瘤細(xì)胞通過宿主細(xì)胞和ECM的屏障,穿越組織的邊界。細(xì)胞分泌的蛋白酶比如纖溶酶原激活劑、絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases, MMPs)幫助腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)這遷移過程。MMPs是一類分解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系十分密切的蛋白水解酶。目前許多研究證明,MMPs的過度表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在MMPs家族中,MMP-2 (72 kD gelatinase A)和MMP-9 (92 kD gelatinase B)是兩個(gè)關(guān)鍵的成員,被認(rèn)為在肝細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程降解基質(zhì)扮演著重要的角色。MMP-2、 MMP-9能降解層粘連蛋白、巢蛋白、明膠,MMP2還激活MMP-9、MMP-13,能降解I型膠原,MMPs共同作用可降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)。肝癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的過程中,必需發(fā)生其基底膜(basementmembrane, BM)的降解,BM呈厚實(shí)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),主要由糖蛋白、Ⅳ型膠原等組成,而Ⅳ型膠原又是BM的主要支架。豐富的資料研究表明,腫瘤細(xì)胞分泌的MMPs中的MMP-2、MMP-9其降解底物是Ⅳ膠原,使BM發(fā)生缺損,促使腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤組織中MMP-2、MMP-9均有表達(dá),尤其在腫瘤邊緣表達(dá)最強(qiáng),而癌周間質(zhì)等癌旁正常組織卻為弱表達(dá)或不表達(dá)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進(jìn)肝癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要有：(1)增加血管的通透性；(2)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；(3)促進(jìn)血管支持物的生成；(4)抑制腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡；(5)激活了PI3K/AKT、FAK/paxillin、Shc/RAS/MAPK及PLC-IP3/DAG-PKC等信號(hào)傳導(dǎo)通路；從而為惡性腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。既往的研究表明：放療可能對(duì)腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)有上調(diào)作用,MMP-2、MMP-9是促進(jìn)腫瘤侵襲中的重要因素,推測(cè)放療引發(fā)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一或是上調(diào)了MMPs的表達(dá),增強(qiáng)了它們的活性。輻射能激活了VEGF-MMP2通路,誘導(dǎo)P53的上調(diào),使受照射的肝癌細(xì)胞和未受照射的肝癌細(xì)胞都增強(qiáng)了侵襲能力。通過PI3K/PTEN/AKT/mTOR途徑,肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移和MMP9的上調(diào)有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn),阻塞小鼠肝臟的動(dòng)脈血流能引起短暫的血液灌注減少和轉(zhuǎn)移相關(guān)的VEGF和MMP的基因的表達(dá),血流灌注的減少和低氧可能引起VEGF表達(dá)的上調(diào)。在數(shù)個(gè)碘油栓塞治療兔VX2肝癌的實(shí)驗(yàn)中,殘留的癌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)了MMP-2、MMP-9及VEGF的高表達(dá)。有相當(dāng)部分HCC患者會(huì)出現(xiàn)VEGF過表達(dá),VEGF的表達(dá)與P53的表達(dá)及腫瘤復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)。TACE后殘留的肝癌組織有豐富的血供,增加了VEGF的表達(dá)�？傊�,亞致死劑量放射線輻照肝癌細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致MMP-2、MMP-9、VEGF表達(dá)增強(qiáng),與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。肝動(dòng)脈栓塞／阻塞治療動(dòng)物的肝腫瘤動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中,亦出現(xiàn)了腫瘤區(qū)的MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)有升高。本研究在建立兔VX2肝癌模型的基礎(chǔ)上,探討VX2兔肝腫瘤放療、兔肝碘油介入栓塞治療和放療聯(lián)合介入治療,對(duì)VX2兔肝腫瘤MMP-2、MMP-9、VEGF表達(dá)的影響。方法1.實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型制備將液氮內(nèi)凍存VX2瘤株37。C水浴箱內(nèi)復(fù)蘇后,取細(xì)胞懸液置傳代培養(yǎng),臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)算出細(xì)胞活率,按1×107/ml活細(xì)胞密度調(diào)制培養(yǎng)液。于兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)接種0.5m1培養(yǎng)液,兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)2周后產(chǎn)生一個(gè)約1cm3實(shí)質(zhì)性的腫物,證明荷瘤兔已經(jīng)制作成功。在2-4周左右進(jìn)行傳代,用25mg/kg1%戊巴比妥鈉耳源靜脈麻醉,在無菌條件下手術(shù)取出荷瘤兔后腿肌肉內(nèi)種植的腫瘤,剖開瘤體后取灰白色質(zhì)硬脆的瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍的組織部分,制成約1mm×1mm ×1mm大小的腫瘤組織塊備用。將實(shí)驗(yàn)大白兔麻醉后,鋪無菌巾,無菌條件下逐層開腹,暴露肝臟,以眼科剪于肝左中央葉表面剪開肝組織并形成開口小“燒瓶”樣竇道,在實(shí)驗(yàn)兔肝內(nèi),直接植入2-3塊已制作好的1mm3左右的瘤塊,并以小塊的明膠海綿填塞封閉竇口。仔細(xì)檢查無活動(dòng)性出血后回納復(fù)位肝臟,逐層關(guān)閉腹腔、縫合皮膚。接種2-3周后用二維超聲檢測(cè)瘤體至1.5 cm左右時(shí),可供以下實(shí)驗(yàn)使用。2.動(dòng)物分組隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)大白兔分成A、B、C、D四組,每組10只。使用碘油1ml對(duì)每只兔肝VX2移植瘤進(jìn)行栓塞治療。A組為對(duì)照組；B組為單純碘油栓塞；C為單純放療組；D組為先碘油栓塞介入治療后聯(lián)合放療組；A、B、D組接種2-3周后進(jìn)行介入治療,C組接種2-3周后進(jìn)行放射治療,D組介入治療后1周后進(jìn)行放射治療。實(shí)驗(yàn)大白兔完成治療后1周處死,取出肝臟標(biāo)本。3.放射治療接受放療的模型兔經(jīng)將大白兔用25 mg/kg 1%戊巴比妥鈉耳源靜脈麻醉后,在木板體模上固定四肢及頭部,大白兔身上安裝定位標(biāo)記,CT掃描范圍自胸廓至整個(gè)腹部水平,層厚2.5 mm,通過數(shù)字顯示屏查看腫瘤種植的肝臟部位。在大白兔耳源靜脈注入碘帕醇10 ml,再次CT掃描。掃描后的CT圖像通過數(shù)字化形式的局域網(wǎng)傳輸?shù)饺S適形治療計(jì)劃系統(tǒng),對(duì)圖像進(jìn)行三維重建后采用三維治療(Three dimensional conformal RT,3D-CRT)計(jì)劃系統(tǒng)設(shè)計(jì)放射治療計(jì)劃。放射治療計(jì)劃在三維治療計(jì)劃系統(tǒng)中設(shè)計(jì),大體腫瘤體積(GTV)加上8 mm擺位誤差和腫瘤的運(yùn)動(dòng)范圍,成為計(jì)劃照射體積(PTV)。勾畫體表輪廓和正常肝組織等重要臟器。劑量參考點(diǎn)位于腫瘤內(nèi),經(jīng)劑量體積直方圖(dose volume histogram, DVH)和等劑量線參考綜合評(píng)價(jià)優(yōu)化治療計(jì)劃,90%的等劑量曲線覆蓋PTV。選擇瓦里安直線加速器(23EX, Varian Medical Systmes, Palo Alto,USA, dose rate of 4Gy/min)放療,6MeV或9MeV電子線,處方劑量為單次劑量15Gy。4.介入治療將實(shí)驗(yàn)兔全麻后,腹部朝上,固定于手術(shù)臺(tái)上,備皮、常規(guī)手術(shù)范圍消毒、鋪無菌巾。根據(jù)腹股溝區(qū)血管走向觸摸股動(dòng)脈搏動(dòng),確定股動(dòng)脈位置,縱行切開皮膚,暴露出兔股動(dòng)脈鞘,股動(dòng)脈鞘內(nèi)可見并行排列的股靜脈、股動(dòng)脈和股神經(jīng),直徑由粗到細(xì)。把股動(dòng)脈從股神經(jīng)與股靜脈中鈍性分離出3cm,用4號(hào)手術(shù)絲線各1根分別穿上已經(jīng)分離的股動(dòng)脈近段和遠(yuǎn)段,結(jié)扎遠(yuǎn)端并提起近段,于暴露的股動(dòng)脈中間段用眼科剪剪開一斜行切口,見有鮮紅色血液噴出,將導(dǎo)管鞘經(jīng)切口緩緩插人股動(dòng)脈近端,動(dòng)脈外留管鞘2厘米,用近端絲線將管鞘與股動(dòng)脈固定,置入3F微導(dǎo)管和導(dǎo)絲。導(dǎo)管經(jīng)股動(dòng)脈、髂動(dòng)脈進(jìn)入腹主動(dòng)脈,第一腰椎水平主動(dòng)脈處注入造影劑,了解肝動(dòng)脈走行及腹腔動(dòng)脈開口位置。沿著微導(dǎo)管置入“J”型導(dǎo)絲于T12-L1之間,導(dǎo)絲頭端朝前,如已到達(dá)腹腔動(dòng)脈開口,導(dǎo)絲會(huì)頭端形態(tài)改變或直接嵌入開口,導(dǎo)管探入腹腔干,注入造影劑,繼續(xù)跟進(jìn)導(dǎo)絲達(dá)肝總動(dòng)脈處,再次注入造影劑,觀察肝動(dòng)脈走行顯示腫瘤血供情況,根據(jù)造影情況進(jìn)行腫瘤血供動(dòng)脈的超選擇插管。行DSA造影檢查后分別注入藥物進(jìn)行介入治療。5. MMPs和VEGF在VX2兔肝腫瘤的表達(dá)研究切取后的腫瘤組織經(jīng)HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察。應(yīng)用免疫組織化學(xué)、定量PCR、Western blotting檢測(cè)MMP-2,9和VEGF表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示, 兩組間比較采用獨(dú)立樣本Bonferroni檢驗(yàn)；單因素多組間比較,采用單因素方差分析(one-way ANOVA);以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.VX2兔肝腫瘤組織經(jīng)HE染色后光學(xué)顯微鏡觀察到：未經(jīng)治療的腫瘤組織內(nèi)包括光亮和較大細(xì)胞核VX2細(xì)胞,在各治療組中均可見存活的VX2細(xì)胞,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死。壞死區(qū)域和未經(jīng)治療的腫瘤組織不一樣,質(zhì)地較硬,顏色蒼白。經(jīng)過放射治療,具有活性的腫瘤細(xì)胞的數(shù)量減少,部分VX2細(xì)胞被纖維組織取代。經(jīng)肝動(dòng)脈導(dǎo)管碘油栓塞后,碘油主要是沉積在腫瘤的邊緣,只有少數(shù)碘油進(jìn)入缺乏血管的腫瘤中央地區(qū)。2.免疫組織化學(xué)染色顯示,VEGF、MMP-2和MMP-9均在各組的腫瘤組織中表達(dá)。他們主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),行VEGF, MMP-2和MMP-9蛋白的定量評(píng)估,選取陽(yáng)性區(qū)域測(cè)定灰度值。在B、C和D組中,VEGF、MMP-2和MMP-9相比A組顯著增加(p0.05)。然而,VEGF和MMP-2、9的含量在B、C和D組之間沒有顯著差異(p0.05)。免疫印跡分析(Western-blot)也用于檢鋇VEGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá),B、C和D組VEGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)對(duì)比A組也有所增加。我們通過實(shí)時(shí)PCR比較了殘余腫瘤細(xì)胞中VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA轉(zhuǎn)錄水平,根據(jù)比較Ct值定量實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果,治療組(B、C、D組)和A組之間比較：VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),但B、C和D組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論VEGF、MMP-2和MMP-9在殘留的腫瘤細(xì)胞的表達(dá)：介入組、放療組和介入加放療組與對(duì)照組相比有明顯增加,介入加放療組中VEGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)對(duì)比單一治療組(介入組、放療組)略減少,然而各治療組間沒有明顯差異。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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1 沈潔;磁共振引導(dǎo)高強(qiáng)度聚焦超聲損傷兔肝的影像學(xué)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

2 凌曉娟;陡脈沖在活體兔肝組織的電場(chǎng)分布和劑量研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

3 栗建輝;應(yīng)用化療藥前后兔肝臟的超聲表現(xiàn)及病理改變的對(duì)照研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2007年

4 陳松旺;乙酸灌注兔肝門靜脈分支致兔肝壞死的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2000年

5 朱愛軍;兔肝血流量變化與磁共振彌散加權(quán)成像的相關(guān)性研究[D];蘭州大學(xué);2007年

6 吳靜;超聲監(jiān)測(cè)陡脈沖治療兔肝腫瘤的可行性研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

7 唐榮;冷極射頻聯(lián)合高頻熱療對(duì)兔肝VX2腫瘤侵襲能力改變的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

8 賈玉柱;低濃度氫氧化鈉對(duì)兔肝VX2腫瘤消融的實(shí)驗(yàn)研究[D];浙江大學(xué);2012年

9 楊曉燕;陡脈沖治療兔肝臟腫瘤安全性、有效性的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

10 郭曉華;射頻對(duì)兔肝癌微血管密度及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的影響[D];武漢大學(xué);2005年

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