【摘要】：研究背景和目的原發(fā)性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma, HCC)是我國最常見的并且是惡性程度最高的惡性腫瘤之一,是一種對人民健康產(chǎn)生嚴重威脅的惡性腫瘤。原發(fā)性肝細胞癌在亞洲具有有很高的發(fā)病率和死亡率。然而,最近晚期肝癌1年存活率仍不到50%。經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化學栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)為肝癌非手術(shù)治療的重要方法之一,經(jīng)股動脈插入導(dǎo)管,將導(dǎo)管超選擇地插入肝固有動脈或腫瘤供血分支,然后經(jīng)導(dǎo)管注入栓塞劑和治療藥物,采用TACE可提高腫瘤局部的藥物濃度,從而提高療效,減少全身副作用。目前,TACE不僅作為不能切除肝癌的主要治療手段,而且能應(yīng)用于可切除的肝癌,有門脈癌栓肝癌,惡性肝轉(zhuǎn)移瘤的治療。放射治療是通過發(fā)射高能的射線破壞腫瘤區(qū)域的細胞DNA,造成細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞。放射治療作為肝癌綜合治療的重要手段,主要適用于不能手術(shù)切除的患者,可以治療肝臟腫瘤及遠處轉(zhuǎn)移灶,但近年來由于放療技術(shù)的發(fā)展,肝癌的放射治療應(yīng)用逐漸增多。三維適形放療及調(diào)強放療是采用三維適形治療或調(diào)強計劃系統(tǒng)進行聚焦式照射,達到精確定位、精確計算和精確治療。正常肝臟對輻射較敏感,肝癌腫瘤與低分化鱗癌有相似的放射敏感性,其放射敏感性在人體中僅次于骨髓、淋巴組織和腎臟。VX2瘤株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌,在兔動物體內(nèi)缺乏該腫瘤的抗體,可接種到動物兔肝臟、腎臟、肌肉、肺臟等部位,制成兔原位腫瘤動物模型。VX2兔肝腫瘤具有與人肝臟富血供腫瘤類似的血供特點,動脈血供豐富,它是在大型動物上建立的富血供肝腫瘤模型,是一種良好的肝腫瘤動物模型。VX2兔肝腫瘤適合行動脈化療栓塞術(shù)、影像學、治療學、抗腫瘤藥物的代謝動力學的實驗性研究。侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性行為的最本質(zhì)特征。細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)是腫瘤細胞進行侵襲和遷移的第一道重要屏障。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的過程,包括細胞粘附到ECM,蛋白酶分泌,ECM降解和腫瘤細胞遷移,其中重要的第一步是腫瘤細胞通過宿主細胞和ECM的屏障,穿越組織的邊界。細胞分泌的蛋白酶比如纖溶酶原激活劑、絲氨酸蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases, MMPs)幫助腫瘤細胞實現(xiàn)這遷移過程。MMPs是一類分解細胞外基質(zhì)、基底膜,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系十分密切的蛋白水解酶。目前許多研究證明,MMPs的過度表達與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在MMPs家族中,MMP-2 (72 kD gelatinase A)和MMP-9 (92 kD gelatinase B)是兩個關(guān)鍵的成員,被認為在肝細胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程降解基質(zhì)扮演著重要的角色。MMP-2、 MMP-9能降解層粘連蛋白、巢蛋白、明膠,MMP2還激活MMP-9、MMP-13,能降解I型膠原,MMPs共同作用可降解所有的細胞外基質(zhì)。肝癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的過程中,必需發(fā)生其基底膜(basementmembrane, BM)的降解,BM呈厚實的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),主要由糖蛋白、Ⅳ型膠原等組成,而Ⅳ型膠原又是BM的主要支架。豐富的資料研究表明,腫瘤細胞分泌的MMPs中的MMP-2、MMP-9其降解底物是Ⅳ膠原,使BM發(fā)生缺損,促使腫瘤細胞向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤組織中MMP-2、MMP-9均有表達,尤其在腫瘤邊緣表達最強,而癌周間質(zhì)等癌旁正常組織卻為弱表達或不表達。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進肝癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移的機制主要有：(1)增加血管的通透性；(2)促進血管內(nèi)皮細胞的增殖；(3)促進血管支持物的生成；(4)抑制腫瘤細胞的調(diào)亡；(5)激活了PI3K/AKT、FAK/paxillin、Shc/RAS/MAPK及PLC-IP3/DAG-PKC等信號傳導(dǎo)通路；從而為惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。既往的研究表明：放療可能對腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達有上調(diào)作用,MMP-2、MMP-9是促進腫瘤侵襲中的重要因素,推測放療引發(fā)促進轉(zhuǎn)移的重要機制之一或是上調(diào)了MMPs的表達,增強了它們的活性。輻射能激活了VEGF-MMP2通路,誘導(dǎo)P53的上調(diào),使受照射的肝癌細胞和未受照射的肝癌細胞都增強了侵襲能力。通過PI3K/PTEN/AKT/mTOR途徑,肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移和MMP9的上調(diào)有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn),阻塞小鼠肝臟的動脈血流能引起短暫的血液灌注減少和轉(zhuǎn)移相關(guān)的VEGF和MMP的基因的表達,血流灌注的減少和低氧可能引起VEGF表達的上調(diào)。在數(shù)個碘油栓塞治療兔VX2肝癌的實驗中,殘留的癌細胞會出現(xiàn)了MMP-2、MMP-9及VEGF的高表達。有相當部分HCC患者會出現(xiàn)VEGF過表達,VEGF的表達與P53的表達及腫瘤復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)。TACE后殘留的肝癌組織有豐富的血供,增加了VEGF的表達�？傊�,亞致死劑量放射線輻照肝癌細胞后會導(dǎo)致MMP-2、MMP-9、VEGF表達增強,與腫瘤進展和不良預(yù)后有關(guān)。肝動脈栓塞／阻塞治療動物的肝腫瘤動物模型的實驗中,亦出現(xiàn)了腫瘤區(qū)的MMP-2、MMP-9、VEGF的表達有升高。本研究在建立兔VX2肝癌模型的基礎(chǔ)上,探討VX2兔肝腫瘤放療、兔肝碘油介入栓塞治療和放療聯(lián)合介入治療,對VX2兔肝腫瘤MMP-2、MMP-9、VEGF表達的影響。方法1.實驗性動物模型制備將液氮內(nèi)凍存VX2瘤株37。C水浴箱內(nèi)復(fù)蘇后,取細胞懸液置傳代培養(yǎng),臺盼藍染色后計算出細胞活率,按1×107/ml活細胞密度調(diào)制培養(yǎng)液。于兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)接種0.5m1培養(yǎng)液,兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)2周后產(chǎn)生一個約1cm3實質(zhì)性的腫物,證明荷瘤兔已經(jīng)制作成功。在2-4周左右進行傳代,用25mg/kg1%戊巴比妥鈉耳源靜脈麻醉,在無菌條件下手術(shù)取出荷瘤兔后腿肌肉內(nèi)種植的腫瘤,剖開瘤體后取灰白色質(zhì)硬脆的瘤細胞生長活躍的組織部分,制成約1mm×1mm ×1mm大小的腫瘤組織塊備用。將實驗大白兔麻醉后,鋪無菌巾,無菌條件下逐層開腹,暴露肝臟,以眼科剪于肝左中央葉表面剪開肝組織并形成開口小“燒瓶”樣竇道,在實驗兔肝內(nèi),直接植入2-3塊已制作好的1mm3左右的瘤塊,并以小塊的明膠海綿填塞封閉竇口。仔細檢查無活動性出血后回納復(fù)位肝臟,逐層關(guān)閉腹腔、縫合皮膚。接種2-3周后用二維超聲檢測瘤體至1.5 cm左右時,可供以下實驗使用。2.動物分組隨機將實驗大白兔分成A、B、C、D四組,每組10只。使用碘油1ml對每只兔肝VX2移植瘤進行栓塞治療。A組為對照組；B組為單純碘油栓塞；C為單純放療組；D組為先碘油栓塞介入治療后聯(lián)合放療組；A、B、D組接種2-3周后進行介入治療,C組接種2-3周后進行放射治療,D組介入治療后1周后進行放射治療。實驗大白兔完成治療后1周處死,取出肝臟標本。3.放射治療接受放療的模型兔經(jīng)將大白兔用25 mg/kg 1%戊巴比妥鈉耳源靜脈麻醉后,在木板體模上固定四肢及頭部,大白兔身上安裝定位標記,CT掃描范圍自胸廓至整個腹部水平,層厚2.5 mm,通過數(shù)字顯示屏查看腫瘤種植的肝臟部位。在大白兔耳源靜脈注入碘帕醇10 ml,再次CT掃描。掃描后的CT圖像通過數(shù)字化形式的局域網(wǎng)傳輸?shù)饺S適形治療計劃系統(tǒng),對圖像進行三維重建后采用三維治療(Three dimensional conformal RT,3D-CRT)計劃系統(tǒng)設(shè)計放射治療計劃。放射治療計劃在三維治療計劃系統(tǒng)中設(shè)計,大體腫瘤體積(GTV)加上8 mm擺位誤差和腫瘤的運動范圍,成為計劃照射體積(PTV)。勾畫體表輪廓和正常肝組織等重要臟器。劑量參考點位于腫瘤內(nèi),經(jīng)劑量體積直方圖(dose volume histogram, DVH)和等劑量線參考綜合評價優(yōu)化治療計劃,90%的等劑量曲線覆蓋PTV。選擇瓦里安直線加速器(23EX, Varian Medical Systmes, Palo Alto,USA, dose rate of 4Gy/min)放療,6MeV或9MeV電子線,處方劑量為單次劑量15Gy。4.介入治療將實驗兔全麻后,腹部朝上,固定于手術(shù)臺上,備皮、常規(guī)手術(shù)范圍消毒、鋪無菌巾。根據(jù)腹股溝區(qū)血管走向觸摸股動脈搏動,確定股動脈位置,縱行切開皮膚,暴露出兔股動脈鞘,股動脈鞘內(nèi)可見并行排列的股靜脈、股動脈和股神經(jīng),直徑由粗到細。把股動脈從股神經(jīng)與股靜脈中鈍性分離出3cm,用4號手術(shù)絲線各1根分別穿上已經(jīng)分離的股動脈近段和遠段,結(jié)扎遠端并提起近段,于暴露的股動脈中間段用眼科剪剪開一斜行切口,見有鮮紅色血液噴出,將導(dǎo)管鞘經(jīng)切口緩緩插人股動脈近端,動脈外留管鞘2厘米,用近端絲線將管鞘與股動脈固定,置入3F微導(dǎo)管和導(dǎo)絲。導(dǎo)管經(jīng)股動脈、髂動脈進入腹主動脈,第一腰椎水平主動脈處注入造影劑,了解肝動脈走行及腹腔動脈開口位置。沿著微導(dǎo)管置入“J”型導(dǎo)絲于T12-L1之間,導(dǎo)絲頭端朝前,如已到達腹腔動脈開口,導(dǎo)絲會頭端形態(tài)改變或直接嵌入開口,導(dǎo)管探入腹腔干,注入造影劑,繼續(xù)跟進導(dǎo)絲達肝總動脈處,再次注入造影劑,觀察肝動脈走行顯示腫瘤血供情況,根據(jù)造影情況進行腫瘤血供動脈的超選擇插管。行DSA造影檢查后分別注入藥物進行介入治療。5. MMPs和VEGF在VX2兔肝腫瘤的表達研究切取后的腫瘤組織經(jīng)HE染色,光學顯微鏡觀察。應(yīng)用免疫組織化學、定量PCR、Western blotting檢測MMP-2,9和VEGF表達水平。統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示, 兩組間比較采用獨立樣本Bonferroni檢驗；單因素多組間比較,采用單因素方差分析(one-way ANOVA);以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.VX2兔肝腫瘤組織經(jīng)HE染色后光學顯微鏡觀察到：未經(jīng)治療的腫瘤組織內(nèi)包括光亮和較大細胞核VX2細胞,在各治療組中均可見存活的VX2細胞,炎癥細胞浸潤和壞死。壞死區(qū)域和未經(jīng)治療的腫瘤組織不一樣,質(zhì)地較硬,顏色蒼白。經(jīng)過放射治療,具有活性的腫瘤細胞的數(shù)量減少,部分VX2細胞被纖維組織取代。經(jīng)肝動脈導(dǎo)管碘油栓塞后,碘油主要是沉積在腫瘤的邊緣,只有少數(shù)碘油進入缺乏血管的腫瘤中央地區(qū)。2.免疫組織化學染色顯示,VEGF、MMP-2和MMP-9均在各組的腫瘤組織中表達。他們主要表達于腫瘤細胞的細胞質(zhì)中。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),行VEGF, MMP-2和MMP-9蛋白的定量評估,選取陽性區(qū)域測定灰度值。在B、C和D組中,VEGF、MMP-2和MMP-9相比A組顯著增加(p0.05)。然而,VEGF和MMP-2、9的含量在B、C和D組之間沒有顯著差異(p0.05)。免疫印跡分析(Western-blot)也用于檢鋇VEGF、MMP-2、MMP-9的表達,B、C和D組VEGF、MMP-2和MMP-9的表達對比A組也有所增加。我們通過實時PCR比較了殘余腫瘤細胞中VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA轉(zhuǎn)錄水平,根據(jù)比較Ct值定量實時PCR的結(jié)果,治療組(B、C、D組)和A組之間比較：VEGF、MMP-2和MMP-9的nRNA轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),但B、C和D組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論VEGF、MMP-2和MMP-9在殘留的腫瘤細胞的表達：介入組、放療組和介入加放療組與對照組相比有明顯增加,介入加放療組中VEGF、MMP-2和MMP-9的表達對比單一治療組(介入組、放療組)略減少,然而各治療組間沒有明顯差異。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鐘婭麗;栗建輝;田文艷;唐曉輝;邸桂新;;應(yīng)用化療藥前后兔肝臟的超聲表現(xiàn)及其病理改變的對照研究[J];河北醫(yī)藥;2010年19期

2 魏聰;孫迪;申鍔;胡兵;;冷熱交替消融正常兔肝的影像學與病理學研究[J];中國醫(yī)學影像技術(shù);2014年03期

3 孔凡斌,伍烽,王芷龍,白晉,王智彪;高強度超聲治療早期兔肝臟腫瘤[J];中華實驗外科雜志;2001年01期

4 楊康健;趙思源;趙斌羽;曹瑋;李超;楊清峰;王執(zhí)民;張洪新;;兔肝癌改良接種模型的生長特性研究[J];介入放射學雜志;2010年03期

5 郭文旭;尤富生;史學濤;董秀珍;;溫度對兔肝組織介電特性影響的基礎(chǔ)研究[J];醫(yī)療衛(wèi)生裝備;2012年04期

6 歐陽祖彬,黃永火,文明,朱明霞,陳鑫;稀硫酸溶液兔肝內(nèi)注射的實驗研究[J];重慶醫(yī)科大學學報;2005年01期

7 王振中;殷志康;袁仕取;任耀輝;王勤;馮郁芬;黃麗清;;聚焦超聲輻照在體兔肝的生物效應(yīng)Ⅱ——超微結(jié)耕變化[J];電子顯微學報;1986年03期

8 胡慧;蘇曉慶;;水環(huán)境中兔肝粉和葵花籽粉對貴陽腐霉的影響[J];貴陽醫(yī)學院學報;2013年05期

9 洪明光,王茂音,方敏;親和層析純化兔肝谷胱甘肽過氧化物酶[J];安徽醫(yī)科大學學報;1991年03期

10 朱世華,沈燕華,賀聲,栗克湘,張云山,辛紅;高溫蒸餾水注射離體豬肝及活體兔肝的實驗研究[J];海軍總醫(yī)院學報;2001年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 朱世華;沈燕華;賀聲;栗克湘;張云山;辛紅;;高溫蒸餾水離體豬肝及活體兔肝注射實驗研究[A];中華醫(yī)學會第一次全國介入醫(yī)學學術(shù)會議論文匯編[C];2001年

2 王冬梅;韓冰;范海建;;兔肝癌模型的改進與螺旋CT監(jiān)測[A];2010中華醫(yī)學會影像技術(shù)分會第十八次全國學術(shù)大會論文集[C];2010年

3 劉桂珍;李秋榮;靳月華;;兔肝MT清除羥自由基的作用[A];第十屆全國波譜學學術(shù)會議論文摘要集[C];1998年

4 龍清云;周軍;方瑜;胡金香;;當歸對兔肝纖維化肝癌介入治療后肝纖維化的作用[A];2010湖北省腫瘤介入治療學術(shù)大會論文匯編[C];2010年

5 鄧圻瑋希;閔蘇;何開華;魏珂;;控制性低中心靜脈壓減輕兔肝缺血再灌注腎損傷[A];第十五次長江流域麻醉學學術(shù)年會暨2010年中南六省麻醉學學術(shù)年會暨2010年湖北省麻醉學學術(shù)年會論文集[C];2010年

6 張盟輝;;射頻聯(lián)合亞砷酸治療兔肝VX2腫瘤的療效觀察[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

7 何煒;王維;周平;章雅琴;周鵬;王利華;胡躍群;李瑞珍;;兔肝VX2腫瘤超聲造影時相劃分:與多排螺旋CT增強掃描對照實驗研究[A];中華醫(yī)學會第16次全國放射學學術(shù)大會論文匯編[C];2009年

8 鄒海蓉;鄒建中;歐霞;王雁;張奕;;低劑量超聲聯(lián)合HIFU輻照與單純HIFU輻照消融兔肝VX2瘤的對比研究[A];第十屆全國超聲心動圖學術(shù)會議論文[C];2010年

9 周曉東;羅文;鞏蕭音;賀建國;;HIFU聯(lián)合SonoVue消融兔肝后病理組織學及細胞凋亡變化的研究[A];中國生物醫(yī)學工程進展——2007中國生物醫(yī)學工程聯(lián)合學術(shù)年會論文集（上冊）[C];2007年

10 張奕;陳菲;鄒建中;李崇雁;王琦;徐杰;;高強度聚焦超聲二次輻照兔肝VX_2移植瘤的實驗研究[A];自主創(chuàng)新與持續(xù)增長第十一屆中國科協(xié)年會論文集（3）[C];2009年

相關(guān)博士學位論文 前9條

1 盧奕宇;放療聯(lián)合介入栓塞對VX2兔肝腫瘤MMPs和VEGF表達的影響[D];南方醫(yī)科大學;2016年

2 賀聲;兔肝種植瘤模型增殖活性及侵襲性的超聲成像觀察[D];第四軍醫(yī)大學;1999年

3 張海峰;兔肝VX2移植瘤經(jīng)導(dǎo)管動脈內(nèi)栓塞：磁共振擴散成像評價及碘油—乙醇肝動脈內(nèi)栓塞初步技術(shù)可行性分析[D];中國醫(yī)科大學;2008年

4 王富平;基于塑性復(fù)合材料“變形與撞擊”的兔肝臟損傷評估方法研究[D];第三軍醫(yī)大學;2013年

5 何煒;高強度聚焦超聲非熱效應(yīng)損傷兔肝VX2腫瘤機制及影像—病理對照研究[D];中南大學;2010年

6 孫振綱;利用羥基磷灰石納米制作栓塞材料經(jīng)介入途徑治療兔肝VX2腫瘤的實驗研究[D];華中科技大學;2009年

7 孫叢;功能CT對氬氦刀治療兔肝癌模型評價的實驗研究[D];山東大學;2007年

8 趙艷萍;兔肝VX2腫瘤影像病理學特征其射頻消融后影像病理聯(lián)系[D];新疆醫(yī)科大學;2010年

9 相成;灌注成像對兔肝VX_2移植瘤消融療效的預(yù)測及MR彌散成像的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 沈潔;磁共振引導(dǎo)高強度聚焦超聲損傷兔肝的影像學研究[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

2 凌曉娟;陡脈沖在活體兔肝組織的電場分布和劑量研究[D];重慶醫(yī)科大學;2007年

3 栗建輝;應(yīng)用化療藥前后兔肝臟的超聲表現(xiàn)及病理改變的對照研究[D];河北醫(yī)科大學;2007年

4 陳松旺;乙酸灌注兔肝門靜脈分支致兔肝壞死的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2000年

5 朱愛軍;兔肝血流量變化與磁共振彌散加權(quán)成像的相關(guān)性研究[D];蘭州大學;2007年

6 吳靜;超聲監(jiān)測陡脈沖治療兔肝腫瘤的可行性研究[D];重慶醫(yī)科大學;2009年

7 唐榮;冷極射頻聯(lián)合高頻熱療對兔肝VX2腫瘤侵襲能力改變的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

8 賈玉柱;低濃度氫氧化鈉對兔肝VX2腫瘤消融的實驗研究[D];浙江大學;2012年

9 楊曉燕;陡脈沖治療兔肝臟腫瘤安全性、有效性的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2009年

10 郭曉華;射頻對兔肝癌微血管密度及血管內(nèi)皮細胞生長因子的影響[D];武漢大學;2005年

，

本文編號：2357777