【摘要】：食管癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一并且預(yù)后較差,其病死率占惡性腫瘤相關(guān)病死率的第6位,且發(fā)病率逐年上升。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年約15萬(wàn)人死于食管癌,占世界病死率的46.6%(WHO,1997),占我國(guó)發(fā)生率和死亡率的第4位。目前,食管癌的治療模式主要為手術(shù)和放化療相結(jié)合的綜合治療模式,但隨訪資料顯示遠(yuǎn)期治療效果均不理想,總體5年生存率低于10%。近年來,基因靶向治療成為食管癌研究的重點(diǎn),而腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)成為了基因靶向研究的重中之重。TRAIL可以通過識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面死亡受體DR4和DR5激活下游的凋亡通路,引發(fā)進(jìn)一步的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。大量資料表明TRAIL能夠誘導(dǎo)多種癌癥細(xì)胞發(fā)生凋亡,其中包括食管癌細(xì)胞的凋亡。然而,研究中同時(shí)發(fā)現(xiàn)TRAIL也可以激活正常細(xì)胞的凋亡途徑,其凋亡誘導(dǎo)作用不具有特異性。mi RNAs是一類非編碼的小RNA,它們通過特異性靶向結(jié)合m RNA 3’非編碼區(qū)的mi RNA反應(yīng)元件(mi RNA response element,MRE)下調(diào)基因的表達(dá)水平。已有很多mi RNA的異常表達(dá)被報(bào)道參與了腫瘤的發(fā)生。其中mi R-143在食管癌中低表達(dá),并且可能參與了食管癌的發(fā)生。研究表明通過將腫瘤低表達(dá)的mi RNA的MRE連接到治療載體上,可以調(diào)控治療基因的特異性表達(dá)。目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了基于MRE調(diào)控的表達(dá)載體,這些載體被應(yīng)用于多種腫瘤的治療,包括黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌。我們首先研究了mi R-143和mi R-122在食管癌中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示與正常細(xì)胞系相比,mi R-143和mi R-122在食管癌中低表達(dá)。接著我們將構(gòu)建的攜帶mi R-143和mi R-122的MRE熒光素酶報(bào)告載體psi Chek2-143-122轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞,結(jié)果提示在食管癌細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)水平升高,而在正常細(xì)胞中則低表達(dá)或不表達(dá),說明攜帶mi R-143和mi R-122的MRE可以有效的靶向食管癌細(xì)胞表達(dá)。利用我們構(gòu)建的腺病毒載體Ad-TRAIL-143-122及其對(duì)照物Ad-TRAIL同時(shí)感染細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR及免疫印跡方法檢測(cè)各組中TRAIL的m RNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明Ad-TRAIL-143-122載體可以在食管癌細(xì)胞中高表達(dá)TRAIL的m RNA和蛋白,其表達(dá)效率與Ad-TRAIL相近,但在正常細(xì)胞中Ad-TRAIL-143-122載體的TRAIL表達(dá)水平被顯著抑制。通過使用mi RNA的抑制物和相似物分別作用于Ad-TRAIL-143-122處理的食管癌細(xì)胞和正常細(xì)胞,實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組中mi RNA及TRAIL的含量。mi R-143、mi R-122的混合抑制物轉(zhuǎn)染到正常細(xì)胞L-02后,免疫印跡法顯示TRAIL的表達(dá)有所回升。相反的,mi R-143、mi R-122的相似物作用于受Ad-TRAIL-143-122感染的食管癌細(xì)胞后,TRAIL的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。說明TRAIL的m RNA和蛋白水平確實(shí)受到攜帶mi R-143和mi R-122的MRE的調(diào)控。為了評(píng)估構(gòu)建基因治療載體的殺傷能力和對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性,我們利用Western blot檢查各組細(xì)胞中caspase-3及裂解的PARP的表達(dá)水平;應(yīng)用MTT法評(píng)估各組細(xì)胞的活性。免疫印跡法顯示感染了Ad-TRAIL-143-122或Ad-TRAIL的食管癌細(xì)胞中剪切的caspase-3及裂解的PARP均有較高的表達(dá)。相對(duì)的,感染了Ad-TRAIL-143-122的正常細(xì)胞L-02中的相關(guān)凋亡蛋白均不表達(dá)。MTT法顯示Ad-TRAIL-143-122使食管癌細(xì)胞存活能力下降的程度明顯高于正常細(xì)胞,而不攜帶MRE調(diào)控元件的Ad-TRAIL對(duì)兩種細(xì)胞活性的影響無(wú)明顯差別。說明構(gòu)建的Ad-TRAIL-143-122可以有效的殺傷食管癌細(xì)胞,而對(duì)正常細(xì)胞的毒性不明顯。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了我們載體的有效性,用PBS對(duì)照液、Ad-EGFP、Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-143-122分別作用于裸鼠Eca109食管癌體外移植瘤,定期測(cè)量腫瘤直徑;此外設(shè)置無(wú)瘤小鼠作為平行對(duì)照組,檢測(cè)各組小鼠靜脈血清中谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的水平,并用免疫組化方法檢測(cè)各組小鼠肝臟組織中TRAIL蛋白的表達(dá)情況。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Ad-TRAIL-143-122能夠抑制Eca109體外移植瘤的生長(zhǎng),其治療效果和Ad-TRAIL相近;免疫組化結(jié)果顯示感染了Ad-TRAIL-143-122和Ad-TRAIL的雜交瘤小鼠組織中均可以檢測(cè)到TRAIL的表達(dá)。這說明我們構(gòu)建的病毒載體在攜帶腫瘤的動(dòng)物中可以有效的表達(dá)TRAIL蛋白,起到腫瘤治療作用。更重要的是對(duì)無(wú)瘤小鼠的研究表明,注射了Ad-TRAIL的無(wú)瘤小鼠血清中谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯上升,提示Ad-TRAIL具有較強(qiáng)的肝毒性;而PBS對(duì)照組、Ad-EGFP組和Ad-TRAIL-143-122組小鼠血清中谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平無(wú)明顯改變;免疫組化法檢查Ad-TRAIL-143-122組小鼠肝組織切片中TRAIL的表達(dá)受到抑制,而Ad-TRAIL組小鼠肝組織切片中廣泛地檢測(cè)到了TRAIL蛋白的表達(dá)。說明與Ad-TRAIL病毒相比,Ad-TRAIL-143-122病毒具有更好的腫瘤特異性,且對(duì)正常細(xì)胞毒性低。在該項(xiàng)研究中,我們構(gòu)建了一個(gè)攜帶殺傷基因且具有腫瘤特異性MRE的病毒載體。通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示該基因治療載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷具有特異性,更重要的是該載體能夠在治療腫瘤的同時(shí)防止肝毒性的發(fā)生。因此,該基因治療策略可能成為一種治療食管癌的有效方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 郝理;游盛中;馬素華;張東川;羅斌;權(quán)力;;miR-143、miR-145及血管緊張素II在人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2014年04期

2 徐林;陳靜;;血漿miR-143、miR-145與冠脈粥樣硬化程度的關(guān)系[J];海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2012年11期

3 劉立鵬;于瀟華;王曉春;郭小芳;田智;龍昱;粟敏;羅sベ，

本文編號(hào)：2353668