【摘要】：食管癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一并且預后較差,其病死率占惡性腫瘤相關病死率的第6位,且發(fā)病率逐年上升。據(jù)流行病學統(tǒng)計,我國每年約15萬人死于食管癌,占世界病死率的46.6%(WHO,1997),占我國發(fā)生率和死亡率的第4位。目前,食管癌的治療模式主要為手術和放化療相結合的綜合治療模式,但隨訪資料顯示遠期治療效果均不理想,總體5年生存率低于10%。近年來,基因靶向治療成為食管癌研究的重點,而腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)成為了基因靶向研究的重中之重。TRAIL可以通過識別并結合細胞表面死亡受體DR4和DR5激活下游的凋亡通路,引發(fā)進一步的Caspase級聯(lián)反應,從而誘導細胞發(fā)生凋亡。大量資料表明TRAIL能夠誘導多種癌癥細胞發(fā)生凋亡,其中包括食管癌細胞的凋亡。然而,研究中同時發(fā)現(xiàn)TRAIL也可以激活正常細胞的凋亡途徑,其凋亡誘導作用不具有特異性。mi RNAs是一類非編碼的小RNA,它們通過特異性靶向結合m RNA 3’非編碼區(qū)的mi RNA反應元件(mi RNA response element,MRE)下調基因的表達水平。已有很多mi RNA的異常表達被報道參與了腫瘤的發(fā)生。其中mi R-143在食管癌中低表達,并且可能參與了食管癌的發(fā)生。研究表明通過將腫瘤低表達的mi RNA的MRE連接到治療載體上,可以調控治療基因的特異性表達。目前已有多篇文獻報道了基于MRE調控的表達載體,這些載體被應用于多種腫瘤的治療,包括黑色素瘤、神經(jīng)膠質瘤、膀胱癌。我們首先研究了mi R-143和mi R-122在食管癌中的表達情況,結果顯示與正常細胞系相比,mi R-143和mi R-122在食管癌中低表達。接著我們將構建的攜帶mi R-143和mi R-122的MRE熒光素酶報告載體psi Chek2-143-122轉入目的細胞,結果提示在食管癌細胞中熒光素酶表達水平升高,而在正常細胞中則低表達或不表達,說明攜帶mi R-143和mi R-122的MRE可以有效的靶向食管癌細胞表達。利用我們構建的腺病毒載體Ad-TRAIL-143-122及其對照物Ad-TRAIL同時感染細胞,應用實時定量PCR及免疫印跡方法檢測各組中TRAIL的m RNA和蛋白的表達水平。結果表明Ad-TRAIL-143-122載體可以在食管癌細胞中高表達TRAIL的m RNA和蛋白,其表達效率與Ad-TRAIL相近,但在正常細胞中Ad-TRAIL-143-122載體的TRAIL表達水平被顯著抑制。通過使用mi RNA的抑制物和相似物分別作用于Ad-TRAIL-143-122處理的食管癌細胞和正常細胞,實時定量PCR法檢測各組中mi RNA及TRAIL的含量。mi R-143、mi R-122的混合抑制物轉染到正常細胞L-02后,免疫印跡法顯示TRAIL的表達有所回升。相反的,mi R-143、mi R-122的相似物作用于受Ad-TRAIL-143-122感染的食管癌細胞后,TRAIL的表達量呈下降趨勢。說明TRAIL的m RNA和蛋白水平確實受到攜帶mi R-143和mi R-122的MRE的調控。為了評估構建基因治療載體的殺傷能力和對正常細胞的細胞毒性,我們利用Western blot檢查各組細胞中caspase-3及裂解的PARP的表達水平;應用MTT法評估各組細胞的活性。免疫印跡法顯示感染了Ad-TRAIL-143-122或Ad-TRAIL的食管癌細胞中剪切的caspase-3及裂解的PARP均有較高的表達。相對的,感染了Ad-TRAIL-143-122的正常細胞L-02中的相關凋亡蛋白均不表達。MTT法顯示Ad-TRAIL-143-122使食管癌細胞存活能力下降的程度明顯高于正常細胞,而不攜帶MRE調控元件的Ad-TRAIL對兩種細胞活性的影響無明顯差別。說明構建的Ad-TRAIL-143-122可以有效的殺傷食管癌細胞,而對正常細胞的毒性不明顯。動物體內實驗同樣驗證了我們載體的有效性,用PBS對照液、Ad-EGFP、Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-143-122分別作用于裸鼠Eca109食管癌體外移植瘤,定期測量腫瘤直徑;此外設置無瘤小鼠作為平行對照組,檢測各組小鼠靜脈血清中谷丙氨酸氨基轉移酶的水平,并用免疫組化方法檢測各組小鼠肝臟組織中TRAIL蛋白的表達情況。動物實驗表明Ad-TRAIL-143-122能夠抑制Eca109體外移植瘤的生長,其治療效果和Ad-TRAIL相近;免疫組化結果顯示感染了Ad-TRAIL-143-122和Ad-TRAIL的雜交瘤小鼠組織中均可以檢測到TRAIL的表達。這說明我們構建的病毒載體在攜帶腫瘤的動物中可以有效的表達TRAIL蛋白,起到腫瘤治療作用。更重要的是對無瘤小鼠的研究表明,注射了Ad-TRAIL的無瘤小鼠血清中谷丙氨酸氨基轉移酶水平明顯上升,提示Ad-TRAIL具有較強的肝毒性;而PBS對照組、Ad-EGFP組和Ad-TRAIL-143-122組小鼠血清中谷丙氨酸氨基轉移酶水平無明顯改變;免疫組化法檢查Ad-TRAIL-143-122組小鼠肝組織切片中TRAIL的表達受到抑制,而Ad-TRAIL組小鼠肝組織切片中廣泛地檢測到了TRAIL蛋白的表達。說明與Ad-TRAIL病毒相比,Ad-TRAIL-143-122病毒具有更好的腫瘤特異性,且對正常細胞毒性低。在該項研究中,我們構建了一個攜帶殺傷基因且具有腫瘤特異性MRE的病毒載體。通過體內和體外實驗,結果顯示該基因治療載體對腫瘤細胞的殺傷具有特異性,更重要的是該載體能夠在治療腫瘤的同時防止肝毒性的發(fā)生。因此,該基因治療策略可能成為一種治療食管癌的有效方法。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

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