【摘要】：目的:胃癌是消化系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及死亡率一直居高不下,在我國(guó),胃癌死亡率占我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第2位。由于早期胃癌很少有明顯的癥狀,因此大部分患者確診時(shí)已經(jīng)是胃癌晚期,失去手術(shù)機(jī)會(huì),化療成為胃癌主要治療手段之一。順鉑是各期胃癌化療的一線藥物,但是有效率仍然不超過(guò)20%,其中胃癌對(duì)順鉑耐藥是胃癌化療失敗的重要原因。隨著胃癌順鉑耐藥機(jī)制的研究深入,一系列耐藥相關(guān)基因相繼被發(fā)現(xiàn),其中膜聯(lián)蛋白A(Annexins A,ANXA)家族在人胃癌細(xì)胞耐藥中發(fā)揮著重要作用。但是膜聯(lián)蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)是否與人胃癌細(xì)胞AGS順鉑耐藥性相關(guān),目前尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。因此,本研究以人胃癌細(xì)胞AGS為研究對(duì)象,應(yīng)用siRNA干擾技術(shù),通過(guò)抑制ANXA11基因表達(dá)后,檢測(cè)各組人胃癌細(xì)胞AGS對(duì)順鉑敏感性,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組敏感性顯著提高,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討,為緩解胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株AGS和人胃癌細(xì)胞株MGC-803,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative real-time reverse transcription,qPCR)、Western blot檢測(cè)兩株細(xì)胞ANXA11 mRNA及蛋白水平的表達(dá)。設(shè)計(jì)并且合成針對(duì)ANXA11基因的特異性干擾序列siRNA及其陰性對(duì)照序列,ANXA11 siRNA及陰性對(duì)照序列按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū),瞬時(shí)轉(zhuǎn)入人胃癌細(xì)胞AGS,轉(zhuǎn)染24、48、72小時(shí)后分別以qPCR、Western blot分別檢測(cè)ANXA11 mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況,檢測(cè)抑制效果。實(shí)驗(yàn)分組為:轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-2的人胃癌細(xì)胞AGS)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌細(xì)胞AGS)、空白對(duì)照組(人胃癌細(xì)胞AGS),以ANXA11-siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS 24、48、72小時(shí)后,用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞在不同濃度順鉑下的細(xì)胞抑制率并計(jì)算各組細(xì)胞IC50及IC20(考慮IC50順鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS殺傷較大,后續(xù)試驗(yàn)采用IC20順鉑處理細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)分組為:聯(lián)合組(轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-2的人胃癌細(xì)胞AGS并以其IC20順鉑處理)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌細(xì)胞AGS)、空白對(duì)照組(人胃癌細(xì)胞AGS),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組人胃癌細(xì)胞AGS的凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。轉(zhuǎn)染48小時(shí),分別提取各組人胃癌細(xì)胞AGS總mRNA、蛋白,分別應(yīng)用qPCR、Western blot檢測(cè)各組人胃癌細(xì)胞AGS中Bax和Bcl-2mRNA及蛋白水平表達(dá)的改變。結(jié)果:1 ANXA11 mRNA在人胃癌細(xì)胞AGS中的相對(duì)表達(dá)量為:0.086±0.022,ANXA11 mRNA在人胃癌細(xì)胞MGS-803中的相對(duì)表達(dá)量為:0.223±0.008。ANXA11蛋白在人胃癌細(xì)胞AGS中的相對(duì)表達(dá)量為:1.969±0.105,ANXA11蛋白在人胃癌細(xì)胞MGS-803中的相對(duì)表達(dá)量為:0.935±0.078。人胃癌細(xì)胞AGS與人胃癌細(xì)胞MGC-803相比,ANXA11 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高(P0.01)。2 ANXA11-siRNA篩選2.1以ANXA11-siRNA-1,ANXA11-siRNA-2,ANXA11-siRNA-3,ANXA11-siRNA-123轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS 24、48、72小時(shí)后,通過(guò)qPCR檢測(cè)ANXA11 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比,各組ANXA11-siRNA對(duì)ANXA11 mRNA的表達(dá)量均有不同程度的抑制作用(F=20.891,P=0.000),其中ANXA11 siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)最好,以ANXA11-siRNA-2的抑制效率最高,為82.36%。2.2分別以80nM、100 n M、120n M、150 n M ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞24、48、72小時(shí)后,以Western blot檢測(cè)ANXA11蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比,各組對(duì)ANXA11蛋白表達(dá)均具有一定抑制作用(F=51.641,P=0.000),其中ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染48小時(shí)最好,以100n M ANXA11-siRNA-2抑制效率最高,達(dá)到57.03%。3 ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS 48小時(shí)后,對(duì)順鉑的IC50分別為:轉(zhuǎn)染組為:1.923±0.205μg/ml,陰性對(duì)照組為:3.817±0.413μg/ml,空白對(duì)照組為4.280±0.216μg/ml;對(duì)順鉑的IC20分別為:轉(zhuǎn)染組為:0.105±0.012μg/ml,陰性對(duì)照組為:0.289±0.154μg/ml,空白對(duì)照組為0.233±0.329μg/ml。轉(zhuǎn)染ANXA11 siRNA后人胃癌細(xì)胞AGS對(duì)順鉑的敏感性顯著高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(F=149.000,P=0.000)。4轉(zhuǎn)染組凋亡率為(16.557±0.979)%,聯(lián)合組凋亡率為(40.416±1.652)%,陰性對(duì)照組為(6.560±0.680)%,空白對(duì)照組為(5.387±0.620)%。與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比,聯(lián)合組和轉(zhuǎn)染組凋亡率均顯著提高(F=698.733,P=0.000);聯(lián)合組較轉(zhuǎn)染組凋亡率顯著提高(P=0.000)。5 ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染對(duì)Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響qPCR檢測(cè)ANXA11-siRNA-2抑制ANXA11表達(dá)后,Bax、Bcl-2mRNA表達(dá)的改變。結(jié)果顯示,將100n M的ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS 48小時(shí),與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比,聯(lián)合組及轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(F=41.046,P=0.000),Bax mRNA表達(dá)顯著升高(F=34.205,P=0.000);聯(lián)合組較轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(P=0.003),Bax mRNA表達(dá)顯著升高(P=0.014)。Western blot檢測(cè)ANXA11-siRNA-2抑制ANXA11表達(dá)后,Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的改變。結(jié)果顯示,將100n M的ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS 48小時(shí),與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比,聯(lián)合組及轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(F=30.184,P=0.000),Bax蛋白表達(dá)顯著升高(F=41.424,P=0.000);聯(lián)合組較轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P=0.002),Bax mRNA表達(dá)顯著升高(P=0.049)。結(jié)論:1與人胃癌細(xì)胞株MGC-803相比,人胃癌細(xì)胞株AGS中ANXA11mRNA及蛋白表達(dá)較高,通過(guò)抑制ANXA11基因表達(dá)可提高人胃癌細(xì)胞AGS凋亡率。2通過(guò)抑制ANXA11基因表達(dá),可增強(qiáng)順鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞AGS抑制作用,從而提高人胃癌細(xì)胞AGS對(duì)順鉑敏感性。ANXA11可能是參與人胃癌細(xì)胞AGS順鉑耐藥新的基因。3 ANXA11可能通過(guò)上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2、下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá),從而參與人胃癌細(xì)胞株AGS對(duì)順鉑耐藥。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 王海存;曹e，

本文編號(hào)：2352207