【摘要】：目的:胃癌是消化系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率及死亡率一直居高不下,在我國,胃癌死亡率占我國惡性腫瘤死亡率的第2位。由于早期胃癌很少有明顯的癥狀,因此大部分患者確診時已經(jīng)是胃癌晚期,失去手術機會,化療成為胃癌主要治療手段之一。順鉑是各期胃癌化療的一線藥物,但是有效率仍然不超過20%,其中胃癌對順鉑耐藥是胃癌化療失敗的重要原因。隨著胃癌順鉑耐藥機制的研究深入,一系列耐藥相關基因相繼被發(fā)現(xiàn),其中膜聯(lián)蛋白A(Annexins A,ANXA)家族在人胃癌細胞耐藥中發(fā)揮著重要作用。但是膜聯(lián)蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)是否與人胃癌細胞AGS順鉑耐藥性相關,目前尚未見到相關報道。因此,本研究以人胃癌細胞AGS為研究對象,應用siRNA干擾技術,通過抑制ANXA11基因表達后,檢測各組人胃癌細胞AGS對順鉑敏感性,發(fā)現(xiàn)轉染組較陰性對照組及空白對照組敏感性顯著提高,并對其相關機制進行初步探討,為緩解胃癌細胞對順鉑耐藥性提供了一定的實驗依據(jù)。方法:培養(yǎng)人胃癌細胞株AGS和人胃癌細胞株MGC-803,應用實時熒光定量多聚酶鏈式反應(Quantitative real-time reverse transcription,qPCR)、Western blot檢測兩株細胞ANXA11 mRNA及蛋白水平的表達。設計并且合成針對ANXA11基因的特異性干擾序列siRNA及其陰性對照序列,ANXA11 siRNA及陰性對照序列按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書,瞬時轉入人胃癌細胞AGS,轉染24、48、72小時后分別以qPCR、Western blot分別檢測ANXA11 mRNA及蛋白水平的表達情況,檢測抑制效果。實驗分組為:轉染組(轉染ANXA11-siRNA-2的人胃癌細胞AGS)、陰性對照組(轉染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌細胞AGS)、空白對照組(人胃癌細胞AGS),以ANXA11-siRNA轉染人胃癌細胞AGS 24、48、72小時后,用CCK-8法檢測各組細胞在不同濃度順鉑下的細胞抑制率并計算各組細胞IC50及IC20(考慮IC50順鉑對人胃癌細胞AGS殺傷較大,后續(xù)試驗采用IC20順鉑處理細胞)。實驗分組為:聯(lián)合組(轉染ANXA11-siRNA-2的人胃癌細胞AGS并以其IC20順鉑處理)、陰性對照組(轉染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌細胞AGS)、空白對照組(人胃癌細胞AGS),應用流式細胞術對各實驗組人胃癌細胞AGS的凋亡率進行檢測。轉染48小時,分別提取各組人胃癌細胞AGS總mRNA、蛋白,分別應用qPCR、Western blot檢測各組人胃癌細胞AGS中Bax和Bcl-2mRNA及蛋白水平表達的改變。結果:1 ANXA11 mRNA在人胃癌細胞AGS中的相對表達量為:0.086±0.022,ANXA11 mRNA在人胃癌細胞MGS-803中的相對表達量為:0.223±0.008。ANXA11蛋白在人胃癌細胞AGS中的相對表達量為:1.969±0.105,ANXA11蛋白在人胃癌細胞MGS-803中的相對表達量為:0.935±0.078。人胃癌細胞AGS與人胃癌細胞MGC-803相比,ANXA11 mRNA及蛋白表達均顯著升高(P0.01)。2 ANXA11-siRNA篩選2.1以ANXA11-siRNA-1,ANXA11-siRNA-2,ANXA11-siRNA-3,ANXA11-siRNA-123轉染人胃癌細胞AGS 24、48、72小時后,通過qPCR檢測ANXA11 mRNA表達情況。結果顯示,與空白對照組及陰性對照組相比,各組ANXA11-siRNA對ANXA11 mRNA的表達量均有不同程度的抑制作用(F=20.891,P=0.000),其中ANXA11 siRNA轉染48小時最好,以ANXA11-siRNA-2的抑制效率最高,為82.36%。2.2分別以80nM、100 n M、120n M、150 n M ANXA11-siRNA-2轉染胃癌AGS細胞24、48、72小時后,以Western blot檢測ANXA11蛋白表達情況。結果發(fā)現(xiàn),與陰性對照組及空白對照組相比,各組對ANXA11蛋白表達均具有一定抑制作用(F=51.641,P=0.000),其中ANXA11-siRNA-2轉染48小時最好,以100n M ANXA11-siRNA-2抑制效率最高,達到57.03%。3 ANXA11-siRNA-2轉染人胃癌細胞AGS 48小時后,對順鉑的IC50分別為:轉染組為:1.923±0.205μg/ml,陰性對照組為:3.817±0.413μg/ml,空白對照組為4.280±0.216μg/ml;對順鉑的IC20分別為:轉染組為:0.105±0.012μg/ml,陰性對照組為:0.289±0.154μg/ml,空白對照組為0.233±0.329μg/ml。轉染ANXA11 siRNA后人胃癌細胞AGS對順鉑的敏感性顯著高于空白對照組及陰性對照組(F=149.000,P=0.000)。4轉染組凋亡率為(16.557±0.979)%,聯(lián)合組凋亡率為(40.416±1.652)%,陰性對照組為(6.560±0.680)%,空白對照組為(5.387±0.620)%。與空白對照組及陰性對照組相比,聯(lián)合組和轉染組凋亡率均顯著提高(F=698.733,P=0.000);聯(lián)合組較轉染組凋亡率顯著提高(P=0.000)。5 ANXA11-siRNA-2轉染對Bax、Bcl-2基因表達的影響qPCR檢測ANXA11-siRNA-2抑制ANXA11表達后,Bax、Bcl-2mRNA表達的改變。結果顯示,將100n M的ANXA11-siRNA-2轉染人胃癌細胞AGS 48小時,與空白對照組及陰性對照組相比,聯(lián)合組及轉染組Bcl-2 mRNA表達顯著降低(F=41.046,P=0.000),Bax mRNA表達顯著升高(F=34.205,P=0.000);聯(lián)合組較轉染組Bcl-2 mRNA表達顯著降低(P=0.003),Bax mRNA表達顯著升高(P=0.014)。Western blot檢測ANXA11-siRNA-2抑制ANXA11表達后,Bax、Bcl-2蛋白表達的改變。結果顯示,將100n M的ANXA11-siRNA-2轉染人胃癌細胞AGS 48小時,與陰性對照組及空白對照組相比,聯(lián)合組及轉染組Bcl-2蛋白表達顯著降低(F=30.184,P=0.000),Bax蛋白表達顯著升高(F=41.424,P=0.000);聯(lián)合組較轉染組Bcl-2蛋白表達顯著降低(P=0.002),Bax mRNA表達顯著升高(P=0.049)。結論:1與人胃癌細胞株MGC-803相比,人胃癌細胞株AGS中ANXA11mRNA及蛋白表達較高,通過抑制ANXA11基因表達可提高人胃癌細胞AGS凋亡率。2通過抑制ANXA11基因表達,可增強順鉑對人胃癌細胞AGS抑制作用,從而提高人胃癌細胞AGS對順鉑敏感性。ANXA11可能是參與人胃癌細胞AGS順鉑耐藥新的基因。3 ANXA11可能通過上調抑凋亡基因Bcl-2、下調促凋亡基因Bax的表達,從而參與人胃癌細胞株AGS對順鉑耐藥。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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1 王海存;曹e，

本文編號：2352206