【摘要】：背景和目的肝細胞癌(HCC)是常見的惡性腫瘤之一,每年大約有75萬的新發(fā)病例及接近70萬的死亡病例。雖然手術(shù)切除是治療肝癌的最佳治療方案,但是很多的肝癌患者初診時即發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移,而失去了根治的機會,即使是行根治性切除術(shù),其術(shù)后復發(fā)率仍然很高。肝癌的轉(zhuǎn)移與切除術(shù)后的復發(fā)仍是決定預(yù)后的主要障礙,因此,對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究一直是肝癌研究關(guān)注的重點。肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個涉及多種因子的參與十分復雜的過程。肝癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的能力主要是由其基因型決定,促癌基因的激活與抑癌基因的失活均可導致肝癌細胞向侵襲轉(zhuǎn)移表型轉(zhuǎn)化。腫瘤蛋白p53誘導核蛋白1(TP53INP1)定位于人染色體8q22,具有5個外顯子和超過2萬個堿基對。TP53INP1在壓力因素誘導下或在應(yīng)激因子作用下會在組織中大量表達,其編碼兩種蛋白異構(gòu)體,分別為TP53INP1α和TP53INP1β。研究發(fā)現(xiàn),在非惡性胰腺病變中,存在TP53INP1表達；但在原發(fā)性胰腺導管腺癌和轉(zhuǎn)移性腫瘤中,TP53INP1的表達明顯減少或者缺失。與之一致,TP53INP1的表達隨著胃癌的進展而顯著降低,表明TP53INP1與胃癌的侵襲性病理表型顯著相關(guān),并與胃癌細胞凋亡相關(guān)。Ito Y等對81例乳腺癌及癌旁正常肝組織行免疫組化檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織中可觀察到TP53INP1的表達。81例乳腺癌中,45例(55.6%)TP53INP1表達下降。Weng W等發(fā)現(xiàn)36例食管癌中,10例TP53INP1表達下調(diào)。結(jié)腸癌組織中TP53INP1的表達也明顯降低。這些觀察結(jié)果表明,TP53INP1表達降低可能是腫瘤進展的一般特征。另有研究表明,在正常胰腺TP53INP1缺失的動物,以及胰腺癌小鼠模型中胰腺上皮內(nèi)瘤樣病變時,富含半胱氨酸的酸性蛋白(SPARC)基因的表達上調(diào)。而TP53INP1轉(zhuǎn)錄能夠阻止SPARC基因的表達,在小鼠胚胎成纖維細胞和胰腺癌細胞中沉默TP53INP1后可增加細胞遷移。這提示TP53INP1能夠抑制腫瘤細胞遷移。但是近期研究發(fā)現(xiàn),TP53INP1在少數(shù)腫瘤組織中為高表達。Ito Y等發(fā)現(xiàn)38例甲狀腺未分化癌中,有36例(94.7%)高表達TP53INP1。Giusiano S等使用炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子α和白細胞介素6治療后,前列腺癌細胞中TP53INP1表達增強。這提示TP53INP1過度表達可能參與炎癥介導的前列腺癌。在這種情況下,TP53INP1的過表達實際上增強了其致癌作用,這與之在許多其它腫瘤中的抑癌特性相互矛盾。TP53INP1是否作為抑癌基因亦或促癌基因可能與組織類型或者腫瘤微環(huán)境相關(guān)。關(guān)于TP53INP1在原發(fā)性肝癌中的表達情況,其表達與臨床病理特征及生存預(yù)后的關(guān)系,筆者進行了文獻檢索,暫未檢索到公開發(fā)表的相關(guān)文章。本實驗從臨床標本、TP53INP1過表達慢病毒細胞轉(zhuǎn)染以及裸鼠原位移植瘤模型等幾個方面入手進行研究,在組織水平、細胞水平以及動物實驗中探討了TP53INP1對肝癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及細胞凋亡的影響。細胞凋亡、自噬與腫瘤的關(guān)系十分密切,二者之間能夠發(fā)生相互作用,從而對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生復雜的影響。有研究表明,在人骨肉瘤U20S細胞中,TP53INP1通過與ATG8家族蛋白相互作用,誘導自噬過程,從而促進細胞凋亡。但在肝細胞癌中,TP53INP1能否通過此種途徑促進肝癌細胞凋亡目前尚未可知,本文將加以研究探討。材料和方法1.檢測TP53INP1在癌旁正常組織和肝癌組織中的表達：收集南方醫(yī)院肝膽外科手術(shù)室保存的65例肝癌患者的組織標本。每例患者分別取肝癌組織及癌旁正常肝組織(5cm)標本,運用實時定量PCR、western跡實驗、免疫組化法檢測TP53INP1在肝癌組織的表達情況,及其與臨床病理參數(shù)(年齡、性別、有無肝炎感染、血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、病理分化程度、肝硬化、AJCC分期、有無血管浸潤、有無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移)以及預(yù)后的關(guān)系。2.TP53INP1在正常肝細胞株及肝癌細胞株中的表達：收集人正常肝細胞株HL7702,人肝癌細胞株Huh-7、SMMC7721、HepG2,應(yīng)用qRT-PCR方法檢測TP53INP1在不同細胞株中的表達情況。3.構(gòu)建TP53INP1-慢病毒載體并包裝慢病毒：用人cDNA作模板擴增TP53INP1目的基因,經(jīng)酶切連接構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒(PLVX-MCMV-ZSGREEN-PURO-TP53INP1,PLVX-MCMV-ZSGREEN-PURO為陰性對照),酶切驗證并測序。Lipo2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒(pHelper1.0、 pHelper 2.0)至293T細胞,包裝慢病毒。4.建立TP53INP1穩(wěn)定過表達細胞株：用包裝的慢病毒感染HepG2細胞,Puromycin培養(yǎng)基篩選,qPCR檢查和熒光觀察進行驗證。5. TP53INP1對肝癌細胞增殖的影響：MTS法檢測肝癌細胞穩(wěn)定過表達TP53INP1對細胞的增長速度的影響。6. TP53INP1對肝癌細胞周期的影響：流式細胞技術(shù)檢測過表達TP53INP1細胞對細胞周期的影響。7.TP53INP1對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響：Transwell實驗檢測過表達TP53INP1細胞對侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。8.TP53INP1對細胞凋亡的影響：流式細胞技術(shù)分析凋亡細胞比例,探討細胞過表達TP53INP1對細胞凋亡影響。9.建立裸鼠移植瘤模型：小鼠購進后,正常飼養(yǎng)觀察一周,在每只小鼠腹部右側(cè)接種細胞懸液,接種后正常飼養(yǎng),每隔一到二天測量一次腫瘤的大小,繪制成腫瘤增長曲線。10.TP53INP1影響自噬：采用自噬相關(guān)蛋白Western blot檢測以及透視電鏡觀察過表達TP53INP1細胞對細胞自噬的影響。11.統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料用χ±SD描述,配對t檢驗用于比較肝癌和癌旁正常肝組織。細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移采用單因素方差分析(one-way ANOVA);裸鼠腫瘤體積的比較采用組間多重比較LSD法；采用Kaplan-Meire和Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析。以P0.05為差異具有顯著性。結(jié)果1.肝癌組織中TP53INP1的表達情況及其與臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系：(1)TP53INP 1在肝癌組織中的表達情況實時熒光定量PCR的實驗結(jié)果表明,TP53INP1在肝癌組織的表達量為0.4103±0.03674,癌旁正常肝組織中的表達量0.6851±0.05825,兩者相比,差異具有顯著性(p=0.0001)。隨機選取不同分化程度的肝癌患者組織標本,分組行Western Blot實驗,β-actin作為內(nèi)參,結(jié)果表明,TP53INP1在高分化、中分化及低分化等不同分化程度肝癌組織中的表達均較癌旁正常肝組織低,差異具有顯著性。免疫組織化學實驗結(jié)果表明,]TP53INP1在肝癌組織和癌旁正常肝組織的細胞質(zhì)與細胞核中均有表達,細胞質(zhì)中表達強于細胞核。65例肝癌組織標本中TP53INP1蛋白表達陽性為30例,TP53INP1蛋白表達陰性為35例；癌旁正常肝組織中TP53INP1蛋白表達陽性為60例,陰性僅5例,差異具有顯著性(P=0.000)。(2)TP53INP1的表達與AJCC分期(P=0.014)、血管浸潤(P=0.024)存在顯著差異,而與年齡、性別、有無肝炎感染、血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、病理分化程度、肝硬化、有無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等參數(shù)無顯著性差異(P0.05)。(3)單因素分析中,病理分化程度(RFS:P=0.003, HR95%CI=0.521(0.338-0.801);OS:P=0.002,HR95%CI=0.432(0.251-0.744))、AJCC 分期(RFS:P=0.045,HR 95%CI=2.224(1.016-4.869);OS:P=0.020,HR 95%CI=2.943 (1.182-7.327))、血管浸潤(RFS:P= 0.004,HR95%CI=3.004(1.416-6.373);OS:P=0.001,HR95%CI=4.275(1.848-9.889))和TP53INP1表達水平(RFS:P=0.005,HR 95%CI= 2.604(1.345-5.039);OS:P=0.005,HR95%CI=3.403(1.436-8.063))是RFS和OS相關(guān)的重要因素。Cox比例風險多因素分析中,血管浸潤(RFS:P= 0.034,HR 95%CI=2.310(1.065-5.012);OS:P=0.021,HR 95%CI=2.841(1.172-6.884))和TP53INP1(RFS:P=0.017,HR 95%CI= 2.284(1.157-4.511); OS:P=0.032,HR 95%CI=2.680(1.087-6.608)表達水平是影響肝癌患者DFS和OS的獨立預(yù)后因素。且TP53INP1表達水平越低,預(yù)后越差。2.TP53INP1在正常肝細胞株及肝癌細胞株中的表達：qPCR證實在HL7702、Huh-7、SMMC7721、HepG2四種細胞株中,人正常肝細胞株HL7702較肝癌細胞株表達量最高：肝癌細胞株中,Huh7細胞株表達量最高,HepG2細胞株TP53INP1表達量最低。3.構(gòu)建TP53INP1-慢病毒載體并包裝慢病毒：慢病毒重組載體經(jīng)酶切電泳及測序分析,證明過表達TP53INP1載體成功構(gòu)建。包裝的慢病毒通過GFP進行病毒滴度測定。4.成功建立TP53INP1過表達細胞株：包裝好的慢病毒感染后的肝癌細胞經(jīng)Puromycin培養(yǎng)基篩選,通過qPCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TP53INP1過表達慢病毒的穩(wěn)定細胞株目的基因的表達水平顯著高于陰性對照組和空白對照組。通過熒光顯微鏡觀察也證實,獲得穩(wěn)定的細胞株能夠穩(wěn)定表達GFP。證實已成功獲得穩(wěn)定細胞株,選擇TP53INP1表達最低的細胞株進行下一步研究。5. TP53INP1抑制肝癌細胞增殖：MTS分別檢TP53INP1過表達細胞株和對照細胞株培養(yǎng)24h、48h、72h后的細胞活力。實驗證實TP53INP1過表達抑制細胞生長(第2,3,4天,P0.05),細胞培養(yǎng)24小時后TP53INP1過表達細胞株與其對照細胞株增殖能力有顯著性差異。6. TP53INP1延長肝癌細胞周期：流式細胞技術(shù)檢測顯示,TP53INP1過表達HepG2穩(wěn)定細胞株處于G1期的細胞數(shù)明顯比對照細胞株多,表明過表達TP53INP1可延長HepG2細胞從G1期進入S期,進而延長細胞周期。7.TP53INP1抑制肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移：Transwell實驗顯示,TP53INP1過表達的細胞株穿過小室的細胞比空白組和陰性對照組明顯減少(P0.01,6次獨立實驗),表明TP53INP1抑制細胞侵襲。8.TP53INP1促進肝癌細胞凋亡：流式細胞技術(shù)檢測顯示,TP53INP1過表達細胞株早期凋亡細胞(LR)及晚期凋亡細胞(UR)均較對照組凋亡細胞多。TP53INP1過表達細胞株的總細胞凋亡率(UR+LR)也明顯高于空白組和陰性對照組。9. TP53INP1過表達抑制裸鼠腫瘤生長：裸鼠成瘤實驗顯示,TP53INP1過表達細胞株形成的腫瘤最小,陰性對照組次之,空白組最大,說明過表達TP53INP1對腫瘤的生長有明顯抑制作用。10.TP53INP1促進細胞自噬：Western blot檢測顯示在TP53INP1過表達HepG2細胞株中beclinl和LC3-Ⅱ蛋白的表達量明顯較對照細胞株多,表明TP53INP1過表達促進細胞自噬。透視電鏡顯示TP53INP1過表達細胞株細胞核固縮,細胞內(nèi)出現(xiàn)雙層膜自噬體及溶酶體,線粒體嵴疏松溶解,核糖體顆粒模糊分布紊亂。對照細胞株染色質(zhì)松散,核膜清晰,核仁明顯,線粒體排列整齊。TP53INP1過表達細胞株有明顯的自噬體和溶酶體,促進細胞自噬性凋亡。結(jié)論1.免疫組織化學方法檢測表明TP53INP1在肝臟細胞的細胞質(zhì)與細胞核中均有表達,其表達主要位于細胞質(zhì)。TP53INP1表達水平與AJCC分期及血管浸潤密切相關(guān),與其他病理參數(shù)無關(guān)。通過Cox風險比例分析發(fā)現(xiàn),TP53INP1是影響肝癌RFS以及OS的獨立預(yù)后因素。2.實時熒光定量PCR從nRNA水平、免疫蛋白印跡及免疫組化實驗從蛋白表達水平檢測顯示TP53INP1表達在肝癌和癌旁正常肝組織之間存在差異,TP53INP1在癌旁正常肝組織中高表達,肝癌細胞中低表達,提示其可能在肝癌發(fā)展的過程中發(fā)揮抑癌作用。3.使用慢病毒載體成功構(gòu)建TP53INP1過表達細胞株后,通過細胞增殖、細胞侵襲、細胞周期及細胞凋亡檢測等體外細胞學功能實驗,證實TP53INP1抑制肝癌細胞生長及侵襲,延長細胞周期,促進細胞凋亡。4.HepG2細胞過表達TP53INP1后,裸鼠背側(cè)皮下移植成瘤生長緩慢、瘤塊變小,提示TP53INP1抑制裸鼠腫瘤細胞的生長,說明TP53INP1負向調(diào)控肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。5.TP53INP1通過參與自噬過程,促進自噬性凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2352010