【摘要】：研究背景及意義對于惡性腫瘤發(fā)生的確切機制,到目前為止尚不完全明確,但已知是由一系列具有內(nèi)在聯(lián)系的多個步驟組成的、腫瘤細胞與宿主細胞和周圍微環(huán)境之間相互作用的、連續(xù)的、多階段的、極其復(fù)雜的動態(tài)過程,隨著細胞外基質(zhì)異常沉積促進實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤及其微環(huán)境生物力學(xué)特性逐步被認識,在二維(2 dimensional,2D)和三維(3 dimensional,3D)環(huán)境中考察細胞外基質(zhì)力學(xué)對腫瘤細胞生物學(xué)行為影響的研究越來越多。其結(jié)果表明細胞外基質(zhì)力學(xué)不僅影響腫瘤細胞的形態(tài)、增殖、遷移、侵襲,還影響到了腫瘤干細胞的特性和腫瘤細胞的耐藥性等。細胞是生物體的基本組成單位。幾乎所有的哺乳類動物細胞之間存在成分復(fù)雜的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM),細胞外基質(zhì)(ECM)是由細胞合成并分泌到胞外、分布于細胞表面或細胞之間的大分子,組成的一個復(fù)雜的大分子網(wǎng)絡(luò),主要是一些多糖、蛋白或蛋白聚糖,它不屬于任何細胞,是動物組織的一部分。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)決定了結(jié)締組織的特性,使其具有獨特的物理、生物化學(xué)和生物力學(xué)特性。ECM不僅本身可作為細胞膜上受體的配體,還能影響細胞因子的擴散和可接觸性,進而調(diào)節(jié)細胞對微環(huán)境的感受和相互作用,使得各種信號級聯(lián)反應(yīng)由細胞膜傳遞到細胞核。ECM的物理性質(zhì)包括基質(zhì)剛度、孔隙率、不可溶解性、空間排布和取向(拓撲結(jié)構(gòu))以及其他特性。這些特性共同決定了其維持組織結(jié)構(gòu)完整的功能特性,并直接影響細胞的行為及其對微環(huán)境的響應(yīng)。細胞外基質(zhì)具有連接、支持、保水、抗壓及保護等物理學(xué)作用。正常真核細胞,除成熟血細胞外,大多須粘附于特定的細胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活,稱為定著依賴性(anchorage dependence)。例如,上皮細胞及內(nèi)皮細胞一旦脫離了細胞外基質(zhì)則會發(fā)生程序性死亡。細胞只有黏附于一定的基質(zhì)才能進行蛋白和RNA的合成,只有在鋪展?fàn)顟B(tài)下才能進行DNA的復(fù)制。細胞外基質(zhì)可通過結(jié)合生長因子來增強或抑制其活性。不同的細胞外基質(zhì)對細胞增殖的影響不同。例如,成纖維細胞在纖粘連蛋白基質(zhì)上增殖加快,在層粘連蛋白基質(zhì)上增殖減慢；而上皮細胞對纖粘連蛋白及層粘連蛋白的增殖反應(yīng)則相反。腫瘤細胞的增殖喪失了定著依賴性,可在半懸浮狀態(tài)增殖。體外實驗證明,各種細胞脫離了細胞外基質(zhì)呈單個游離狀態(tài)時多呈球形。同一種細胞在不同的細胞外基質(zhì)上粘附時可表現(xiàn)出完全不同的形狀。上皮細胞粘附于基膜上才能顯現(xiàn)出其極性。細胞外基質(zhì)決定細胞的形狀這一作用是通過其受體影響細胞骨架的組裝而實現(xiàn)的。不同細胞具有不同的細胞外基質(zhì),介導(dǎo)的細胞骨架組裝的狀況不同,從而表現(xiàn)出不同的形狀。細胞通過與特定的細胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化。例如,成肌細胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白上則停止增殖,進行分化,融合為肌管。細胞外基質(zhì)可以控制細胞遷移的速度與方向,并為細胞遷移提供“腳手架”例如,纖粘連蛋白可促進成纖維細胞及角膜上皮細胞的遷移；層粘連蛋白可促進多種腫瘤細胞的遷移。細胞的趨化性與趨觸性遷移皆依賴于細胞外基質(zhì)。這在胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷愈合中具有重要意義。細胞的遷移依賴于細胞的粘附與細胞骨架的組裝。細胞粘附于一定的細胞外基質(zhì)時誘導(dǎo)粘著斑的形成,粘著斑是聯(lián)系細胞外基質(zhì)與細胞骨架“鉚釘”。ECM成分的產(chǎn)生、交聯(lián)、降解和重建是一個動態(tài)過程,異常的ECM代謝常常伴隨著疾病的發(fā)生,越來越多的實驗研究表明：在實體惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中往往伴隨著ECM的異常沉積、細胞表面受體表達的變化及組織剛度的增加。利用影像學(xué)技術(shù)手段檢測組織密度或剛度對早期檢查和診斷腫瘤有著重要的臨床意義。異常的ECM一方面直接促進細胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移,另一方面通過影響微環(huán)境中的間質(zhì)細胞,促進腫瘤相關(guān)的血管生成和炎癥發(fā)生,形成成瘤微環(huán)境。正確認識腫瘤細胞和微環(huán)境的力學(xué)特征對于研究細胞外基質(zhì)力學(xué)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其生物學(xué)行為的影響具有極其重要的意義。隨著細胞外基質(zhì)異常沉積促進實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤及其微環(huán)境力學(xué)特性逐步被認識,研究細胞外基質(zhì)力學(xué)對腫瘤細胞生物學(xué)行為影響的報道越來越多。腫瘤細胞外間質(zhì)組織的硬化不僅促進了腫瘤發(fā)生與發(fā)展的進程,還增加了其耐藥性。細胞外基質(zhì)異常沉積引起的藥物耐受歸于以下兩個主要方面原因：(1)降低或抑制藥物的效用(例如限制藥物的擴散和進出細胞的速率)。藥物在具有豐富膠原網(wǎng)絡(luò)的腫瘤組織中滲透比低密度膠原的組織低。(2)提高腫瘤細胞對藥物損傷的耐受性(例如降低凋亡敏感性)。細胞外基質(zhì)介導(dǎo)的整合素信號能抑制化療藥物誘導(dǎo)的凋亡過程。研究報道,相較于軟基底(1kPa),硬基底(12kPa)能抑制順鉑誘導(dǎo)的非小細胞肺癌細胞的凋亡,經(jīng)藥物作用后在軟基底上存活下來的癌細胞的致瘤性比硬基底上存活的癌細胞要強。但是,非小細胞肺癌細胞在極硬(約106 kPa)的基底上對順鉑藥物的敏感性是在5kPa基底上的2倍,這提示在篩選抗癌藥物的時候,考察符合生理病理的細胞外基質(zhì)力學(xué)因素是不容忽視的。Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是最近幾年新發(fā)現(xiàn)的一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究證明Hippo-YAP信號通路是參與調(diào)控器官發(fā)育大小的關(guān)鍵信號通路,這一觀點首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn),Hippo-YAP信號通路屬于抑制生長性信號通路,在進化過程中非常保守,多細胞動物果蠅、小鼠、哺乳動物中都存在Hippo-YAP信號通路。在果蠅中發(fā)現(xiàn)的Hippo-YAP信號傳導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)細胞大小、器官體積的主要信號通路,果蠅中的Hippo-YAP信號通路的成員都能在高等生物中找到對應(yīng)的同源物。Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過促進細胞調(diào)亡和限制細胞增殖的途徑來調(diào)控器官大小的發(fā)育,越來越多的證據(jù)表明Hippo-YAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控可能與人類的腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。人體內(nèi)的各種生理反應(yīng)都是由相應(yīng)的蛋白參與和調(diào)節(jié)的,而這些蛋白的表達水平和活性程度同時也受多水平、多方面的調(diào)節(jié)。蛋白的磷酸化和去磷酸化是蛋白活性調(diào)節(jié)的一種重要的形式,通過磷酸化或去磷酸化,改變了蛋白的生物學(xué)活性。目前蛋白的磷酸化研究已經(jīng)成為基因表達、蛋白組學(xué)、酶動力學(xué)研究中的一個重要方面。在生理狀況下,存在著大量非細胞核的蛋白被磷酸化修飾。在哺乳類動物中,Hippo-YAP信號通路上游的膜蛋白受體感受到胞外的生長抑制信號后,經(jīng)過一系列激酶復(fù)合物的磷酸化級聯(lián)反應(yīng),最終將磷酸化下游的效應(yīng)因子YAP。磷酸化的YAP與細胞骨架蛋白相互作用,被滯留在胞質(zhì)內(nèi),不能進入細胞核行使其轉(zhuǎn)錄激活功能。YAP做為Hippo-YAP信號通路的下游效應(yīng)因子具有轉(zhuǎn)錄激活功能,通過與細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TEAD)結(jié)合,促進下游目的基因的表達,從而促進細胞生長,抑制細胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄,如survivin、cyclinE等,并受其它幾個基因的調(diào)控,如：Mst1/2、WW45、Lats1/2和Mob,這些調(diào)控途徑上游基因中的任何一個發(fā)生變異或者YAP基因的過量表達都將會引起細胞的過量生長。在哺乳類動物細胞中,Hippo-YAP信號通路通過磷酸化和促進細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位來抑制YAP及其同系物TAZ的功能。TEAD家族轉(zhuǎn)錄因子是進化上保守的影響YAP生物功能的關(guān)鍵因子。YAP是一個候選的致癌基因,而Hippo-YAP信號通路上的其他幾個因子是腫瘤抑制因子。如果Hippo-YAP信號通路功能失調(diào)將導(dǎo)致癌細胞喪失接觸性抑制(癌細胞不受接觸性抑制局限將更容易擴散,腫瘤灶將更快地擴散)。有研究表明,YAP基因是一個潛在致癌基因。一方面,YAP能夠與細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄增強因子TEAD結(jié)合,促進腫瘤細胞DNA的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生腫瘤細胞的促增殖作用；另一方面,YAP又能夠誘導(dǎo)Survivin等凋亡抑制因子轉(zhuǎn)錄的增加,從而發(fā)揮腫瘤細胞的凋亡抑制作用。YAP作為Hippo-YAP信號通路下游核心作用因子在哺乳類動物中高度保守,YAP在發(fā)揮生物學(xué)作用過程中,不可能負責(zé)整個過程的每一步,它可以提供有利于細胞增殖和抑制細胞凋亡的微環(huán)境,增加細胞惡性轉(zhuǎn)化前細胞相關(guān)基因組的不穩(wěn)定性,提高下游目的基因的表達水平,增強細胞惡性轉(zhuǎn)變的能力,YAP在細胞生長,分化,凋亡過程中發(fā)揮的作用,表明它在維持組織器官的穩(wěn)定性中發(fā)揮的作用,如果YAP一旦功能失調(diào),便有利于正常細胞向惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)化。非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移均依賴于細胞外基質(zhì)沉積和交聯(lián),間質(zhì)剛度增加,同時腫瘤細胞軟化,最終形成異質(zhì)性的腫瘤力學(xué)微環(huán)境。基質(zhì)力學(xué)通過影響腫瘤細胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)移、EMT、腫瘤干細胞特性以及耐藥性等調(diào)控腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,然而,YAP與細胞外基質(zhì)力學(xué)對非小細胞肺癌生長的研究,目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)的報道。本研究將針對YAP通過細胞外基質(zhì)力學(xué)調(diào)節(jié)非小細胞肺癌細胞的生長進行研究。目的：采用不同硬度的培養(yǎng)基質(zhì)與RNA干擾技術(shù)特異性抑制非小細胞肺癌細胞內(nèi)YAP蛋白的表達,探討YAP蛋白與細胞外基質(zhì)力學(xué)調(diào)節(jié)非小細胞肺癌的生長的機制。方法：通過調(diào)整丙烯酰胺和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的用量,生成不同硬度的培養(yǎng)基質(zhì),采用細胞免疫熒光技術(shù)和western blot檢測不同硬度培養(yǎng)基質(zhì)的非小細胞肺癌細胞株SPCA-1中YAP在細胞內(nèi)的定位和蛋白的表達水平,以脂質(zhì)體2000作為轉(zhuǎn)染試劑,將特異性沉默YAP基因的siRNA轉(zhuǎn)染在不同硬度培養(yǎng)基質(zhì)中的細胞株內(nèi),western blot檢測干擾效果,以及實時熒光定量PCR、western blot檢測CTGF、 AREG、Survivin、Ki67在mRNA水平和蛋白水平上的表達變化。結(jié)果：通過調(diào)整丙烯酰胺和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的用量,生成不同硬度的fibronectin-coated PA凝膠。在40kPa基板上培養(yǎng)的細胞中,YAP主要定位于細胞核。在4kPa基板上培養(yǎng)的細胞中,YAP主要定位于細胞質(zhì)中,細胞核中的YAP相對于40kPa基板上培養(yǎng)的細胞明顯低表達,YAP蛋白的表達在硬基質(zhì)上培養(yǎng)后非常顯著增加(P0.001)。而p-YAP和LATS1蛋白的表達在硬基質(zhì)上培養(yǎng)后明顯減少。合成的siYAP能顯著抑制SPCA-1細胞中YAP蛋白的表達,在40kPa基板上培養(yǎng)的細胞在YAP基因沉默后,細胞增殖率顯著降低,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在4kPa基板上培養(yǎng)的細胞在YAP基因沉默后,細胞增殖率無顯著差異。此外正常表達YAP的SPCA-1細胞中,在4kPa基板上培養(yǎng)的細胞增殖率相對于在40kPa基板上培養(yǎng)的細胞增殖率顯著降低,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在40kPa基板上培養(yǎng)的細胞中,YAP基因沉默后,CTGF、 AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白表達水平顯著降低,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),在4kPa基板上培養(yǎng)的細胞中,YAP基因沉默后,CTGF、 AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白的表達水平無明顯降低。正常表達YAP的SPCA-1細胞中,在4kPa基板上培養(yǎng)的細胞相對于在40kPa基板上培養(yǎng)的細胞,CTGF、AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白表達水平均顯著降低,兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：細胞外基質(zhì)的硬度影響了非小細胞肺癌細胞的生物學(xué)行為,YAP通過細胞外基質(zhì)力學(xué)調(diào)節(jié)非小細胞肺癌的生長,揭示Hippo-YAP信號通路通過特定的微環(huán)境調(diào)節(jié)非小細胞肺癌的生長。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【共引文獻】

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本文編號：2343978