【摘要】：目的:Hippo-YAP通路是調節(jié)細胞增殖,細胞間接觸抑制以及組織器官大小的關鍵通路之一,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關重要的作用。該通路中共轉錄因子YAP1由于缺少DNA結合結構域,可通過結合轉錄因子TEAD4從而靶定并調控下游基因的轉錄,從而實現(xiàn)對細胞增值和組織器官發(fā)育的調控作用。YAP1作為Hippo-YAP通路中的核心因子,是已經(jīng)有很多報道的原癌基因,也是目前臨床診斷和治療癌癥的重要靶點,對其細胞生物功能進行分子機制層面的深入探討,發(fā)現(xiàn)新的具有拮抗作用的信號通路具有重要意義。在現(xiàn)有的模型中,Hippo通路主要是通過蛋白磷酸化和泛素化降解機制來調控的。除此之外,在RNA調控水平上,一些Hippo通路的重要組成成分受到了選擇性剪接的調控。RNA選擇性剪接是決定蛋白多樣性的重要原因。選擇性剪接的發(fā)生依賴基因順式作用元件及其招募的反式作用因子,其中剪接因子的細胞特異性和組織特異性表達,細胞核內外定位,及其活性影響著剪接事件的最終結果。選擇性剪接異常會導致蛋白功能異常,與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。越來越多的證據(jù)表明RNA的異常剪接可以影響腫瘤的重要表型特征,但剪接異常的生物學影響特別是在腫瘤中的生物學影響仍然少有報道。在本實驗室前期研究中發(fā)現(xiàn),剪接因子RBM4在腫瘤中的異常表達可以促使TEAD4產(chǎn)生一種短的剪接本,命名為TEAD4-S。TEAD4-S和經(jīng)典剪接本TEAD4-FL的蛋白結構域的不同,很可能影響到YAP1的促癌功能。本文的研究旨在從RNA剪接調控的層面闡明TEAD4異常剪接在腫瘤中的功能及其調控Hippo-YAP通路的具體機制。方法:1.通過PCR和Western blot的實驗方法檢測TEAD4-S在H157細胞和不同組織器官中的表達情況。2.通過免疫熒光實驗技術觀察TEAD4-S的細胞定位。3.構建四環(huán)素誘導穩(wěn)定表達RBM4的HEK293T細胞系,在四環(huán)素的誘導下通過PCR和Western blot的方法檢測RBM4對TEDA4剪接的影響。以及在不同的過表達RBM4的腫瘤細胞系中檢測其對TEAD4剪接的影響。4.通過構建剪接報告基因、引入突變、RIP等實驗方法闡述RBM4影響TEAD4剪接的具體靶定位點。5.用免疫共沉淀實驗證明TEAD4-S是否與YAP存在相互作用。6.通過染色質免疫共沉淀實驗驗證TEAD4-S是否仍然具有靶向DNA的功能。7.通過瞬時轉染,免疫共沉淀實驗驗證TEAD4-S是否影響了TEAD4-FL與YAP的結合能力。8.使用熒光素酶報告系統(tǒng)等方法驗證TEAD4-S對YAP共轉錄活性的影響。9.通過軟瓊脂、平板克隆、Western blot實驗評估TEAD4-S對H157,A549細胞系增殖和EMT的影響。10.建立動物模型,驗證TEAD4-S在體內環(huán)境下對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。結果:1.TEAD4-S在H157細胞和不同組織器官中均有表達。2.TEAD4-S在核質中均勻表達,TEAD4-FL則主要定位在細胞核中。3.RBM4的表達調控了TEAD4-S的產(chǎn)生。4.RBM4是通過CGGCCGG基序來實現(xiàn)對TEAD4剪接調控的。5.TEAD4-S C端依然具有和YAP結合的功能。6.TEAD4-S N端失去了靶向靶基因的功能。7.TEAD4-S的存在破壞了TEAD4-FL和YAP的相互作用。8.TEAD4-S可以通過拮抗TEAD4-FL來影響YAP的活性。9.TEAD4-S的過表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。10.在小鼠移植瘤模型中,TEAD4-S的表達可以抑制腫瘤的增長。TEAD4-S在人的腫瘤中是低表達的,并且TEAD4-S表達量高的腫瘤病人有更長的總體生存期。結論:抑癌剪接因子RBM4的高表達可以上調TEAD4-S,TEAD4-S失去了DNA靶向功能但依然可以結合YAP,進而通過拮抗TEAD4-FL抑制了YAP的活性,從而抑制了腫瘤的生長。據(jù)目前我們了解所知,這是首次報道Hippo-YAP通路可以受到RNA剪接的調控。該研究模型為我們提供了一種全新的腫瘤研究思路和策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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本文編號：2342877