【摘要】：第一部分aPKC-τ和E-Cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性研究目的：檢測aPKC-τ和E-Cadherin在膽管癌組織中的表達(dá),并探討兩者的表達(dá)與膽管癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。方法：選取自2008年1月到2013年6月期間華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科64例經(jīng)手術(shù)切除及經(jīng)病理證實(shí)的膽管癌組織及10例膽總管囊腫病人膽管組織標(biāo)本為研究對(duì)象。采用免疫組化(IHC)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、免疫印跡法(Western blot)方法檢測上述組織標(biāo)本中aPKC-τ、E-Cadherin基因和蛋白的差異表達(dá)情況。采用卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)檢測aPKC-τ和E-Cadherin的表達(dá)與臨床病理分化和TNM分期的關(guān)系,采用Cox多因素回歸分析膽管癌患者預(yù)后獨(dú)立影響因素。結(jié)果：aPKC-τ在51.56%的膽管癌組織中呈高表達(dá)(33/64),在76.56%的癌旁組織中呈低表達(dá)(49/64),而正常組織中低表達(dá)則占100%(10/10)。aPKC-τ在膽管癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(x2=10.8,P=0.001)、正常組織(x2=9.306,P=0.002)。E-cadherin在67.2%的膽管癌組織中呈低表達(dá)(43/64),在32.8%的癌旁組織(21/64)和90%的正常組織(9/10)中呈高表達(dá)。E-cadherin在膽管癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(x2=16.949,P0.001)、正常組織(x2=10.614,P0.001)。aPKC-τ的表達(dá)水平與膽管癌分化程度呈負(fù)相關(guān)(x2=9.002,P==0.003),與膽管癌TNM分期密切相關(guān),呈正相關(guān)(x2=7.000,P=0.008)。E-cadherin的表達(dá)水平與膽管癌分化程度呈正相關(guān)(x2=6.585,P0.001),與膽管癌TNM分期呈負(fù)相關(guān)(x2=5.505,P0.001)。Cox多因素回歸分析顯示,腫瘤分化程度、TNM分期、aPKC-i及E-cadherin表達(dá)水平是影響膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論：aPKC-i和E-Cadherin的表達(dá)水平與膽管癌的分化程度、TNM分期及預(yù)后密切相關(guān),并且是膽管癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。第二部分aPKC-τ通過Snail調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞EMT目的：研究aPKC-τ調(diào)控膽管癌細(xì)胞EMT過程中的分子機(jī)制。方法：體外傳代培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞系TFK-1至對(duì)數(shù)期。合成攜帶aPKC-τ低表達(dá)(aPKC-i-siRNA)、aPKC-τ過表達(dá)(aPKC-τ-saRNA)的慢病毒包裝質(zhì)粒,并構(gòu)建穩(wěn)定aPKC-τ低表達(dá)TFK-1細(xì)胞(aPKC-τ-siRNA-TFK-1)、aPKC-、τ過表達(dá)TFK-1細(xì)胞(aPKC-τ-saRNA-TFK-1)、實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組(Blank)及陰性對(duì)照組(Control),并采用qRT-PCR、Western Blot檢測不同實(shí)驗(yàn)組aPKC-τ、E-cadherin、Vimentin、Snai1、Snai2表達(dá)情況。為進(jìn)一步檢測aPKC-τ調(diào)節(jié)EMT過程中的關(guān)鍵作用靶點(diǎn),選取aPKC-τ過表達(dá)組TFK-1(aPKC-τ-saRNA-TFK-1)細(xì)胞,運(yùn)用Si-RNA技術(shù)靶向下調(diào)Snail表達(dá),設(shè)置空白對(duì)照組(Blank),采用qRT-PCR、Western Blot檢測不同實(shí)驗(yàn)組aPKC-τ、E-cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)情況。結(jié)果：和Blank、Control組比較,伴隨著aPKC-τ的表達(dá)下調(diào),aPKC-τ-siRNA-TFK-1細(xì)胞中的E-cadherin表達(dá)量明顯增高,Vimentin表達(dá)量則顯著降低,Snail的表達(dá)量出現(xiàn)下降；而aPKC-τ過表達(dá)的aPKC-τ-saRNA-TFK-1細(xì)胞中上述標(biāo)志物的表達(dá)情況則正好相反。各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Snai2的表達(dá)量則無明顯變化。aPKC-i-saRNA-TFK-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染Si-Snail后,和對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組aPKC-τ表達(dá)無差異,伴隨著Snail的表達(dá)量下降,其E-cadherin表達(dá)量出現(xiàn)升高,Vimentin表達(dá)量則出現(xiàn)下降。結(jié)論：aPKC-i是調(diào)節(jié)膽管癌EMT過程中的關(guān)鍵分子,并且該調(diào)節(jié)作用是依賴于轉(zhuǎn)錄因子Snail的介導(dǎo)作用來完成的。第三部分aPKC-τ調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞化療抵抗作用中的機(jī)制研究目的：研究aPKC-τ調(diào)控膽管癌細(xì)胞化療抵抗作用中的機(jī)制。方法：體外傳代培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞系TFK-1至對(duì)數(shù)期。選取Blank、 aPKC-τ-siRNA-TFK-1、aPKC-i-saRNA-TFK-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別使用不同濃度吉西他濱(0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)、順鉑(1μg/ml)、 10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml)作用于上述細(xì)胞,采用CCK-8方法檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在藥物作用12h、24h、48h、72h的細(xì)胞生存率,并計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50值。采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在不同藥物最佳濃度作用后細(xì)胞的凋亡情況。最后采用Western blot檢測上述實(shí)驗(yàn)中藥物抵抗蛋白P-gp、凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)情況。結(jié)果：CCK-8檢測結(jié)果顯示,吉西他濱、順鉑對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用具有濃度及時(shí)間依賴性,隨著藥物作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長,三種細(xì)胞的生存率均出現(xiàn)不同程度的下降。其中,aPKC-τ-siRNA-TFK-1細(xì)胞的下降程度最為明顯。Blank、aPKC-τ-siRNA-TFK-1、aPKC-τ-saRNA-TFK-1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的IC50值分別為1.52μg/ml、0.56μg/ml、2.78μg/ml(p0.001),對(duì)順鉑的IC50值則分別為9.3μg/ml、5.7μg/ml、16.3μg/ml(P0.001)。流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果表明,藥物對(duì)aPKC-τ-siRNA-TFK-1細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用最為明顯,而aPKC-τ-saRNA-TFK-1細(xì)胞則未見明顯凋亡。Western blot結(jié)果顯示,aPKC-τ-siRNA-TFK-1細(xì)胞中藥物抵抗蛋白P-gp的表達(dá)量較對(duì)照組明顯下降,藥物作用后凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高；而aPKC-τ-saRNA-TFK-1細(xì)胞中的結(jié)果則相反。結(jié)論：aPKC-τ能夠降低膽管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)P-gp的表達(dá)來產(chǎn)生藥物抵抗。同時(shí),aPKC-i能通過下調(diào)凋亡蛋白Caspase3的表達(dá),參與調(diào)節(jié)化療藥物誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡的過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.8

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本文編號(hào)：2337130