【摘要】：前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi)高居男性癌癥致死原因的前列。雖然在我國前列腺癌的發(fā)病率低于西方歐美國家,但隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高,人們生活方式的改變及生活水平的提高,前列腺癌的發(fā)病率逐年迅速上升,年平均增長率高達(dá)12.1%,而大城市更是成為重災(zāi)區(qū)。目前對前列腺的治療主要以手術(shù)為主,輔以放射性治療及化療。如若早期診斷前列腺癌并進(jìn)行綜合治療,手術(shù)效果顯著,病人預(yù)后較好,但是因?yàn)榍傲邢侔┢鸩‰[匿,容易被忽視,大多數(shù)前列腺癌患者是在被確診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移,而轉(zhuǎn)移及隨后而來的并發(fā)癥成為前列腺癌患者的主要死亡原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)和間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial 1 transformation, MET)被認(rèn)為是癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移的起始或者終止階段中的關(guān)鍵步驟。在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中,癌癥細(xì)胞由上皮形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化,細(xì)胞間黏附能力減弱,細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng),細(xì)胞獲得自由改變形態(tài)的能力�；诖�,前列腺癌細(xì)胞在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化后獲得更強(qiáng)的運(yùn)動和侵襲能力,這使得他們能夠穿過細(xì)胞基底膜、血管內(nèi)膜進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),在其他部位發(fā)生間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化而形成新的轉(zhuǎn)移灶。上述便是前列腺癌轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟。因此尋找與EMT或者M(jìn)ET相關(guān)的基因成為當(dāng)下前列腺癌研究的熱點(diǎn)。泛素蛋白酶體途徑是蛋白降解的主要途徑,在此過程中,泛素(76個氨基酸組成的多肽)在ATP的作用下被泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)轉(zhuǎn)移至泛素偶聯(lián)酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2),再由泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)轉(zhuǎn)移至底物蛋白上。當(dāng)?shù)孜锏鞍捉Y(jié)合一個或者多個泛素后會被蛋白酶體識別進(jìn)而被降解為多肽。E2在蛋白泛素化降解過程中起著承前啟后的作用,UBE2T (ubiquitin-conjugating enzyme 2T)是近期發(fā)現(xiàn)的E2家族的一員。目前,關(guān)于UBE2T的研究主要集中在起在DNA損傷修復(fù)途徑中的作用,主要是UBE2T參與FA通路(Fanconi anemia pathway)過程中FANCD2的泛素化,從而激活DNA損傷修復(fù)過程。也有研究證明UBE2T在乳腺癌中作為潛在的癌基因能夠抑制乳腺癌抑癌基因BRCA1/BRCA2的表達(dá),從而促進(jìn)乳腺癌的增殖轉(zhuǎn)移。然而UBE2T在腫瘤中的作用少見報道,其作用機(jī)制尚不明確,因此進(jìn)步研究UBE2T在腫瘤的作用及機(jī)制是未來UBE2T研究的重點(diǎn)。本研究主要探討UBE2T在前列腺癌中促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用,并深入探討其分子機(jī)制。該研究不僅補(bǔ)充了UBE2T在腫瘤中的生物學(xué)功能,還進(jìn)一步完善了其作用機(jī)制。同時,也為臨床前列腺癌的診斷和治療提供新的可能靶點(diǎn)。第一部分E2泛素偶聯(lián)酶UBE2T與前列腺和乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性究[目的]應(yīng)用前列腺癌、乳腺癌組織芯片研究UBE2T在不同臨床病理分級的前列腺癌和乳腺癌組織中的表達(dá)差異,分析UBE2T與前列腺癌、乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,為進(jìn)一步研究UBE2T在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用打下基礎(chǔ)。[方法]1·運(yùn)用西安艾莉娜生物科技有限公司的前列腺癌組織芯片PR483a,采用免疫組織化學(xué)法檢測UBE2T在正常前列腺組織、原位前列腺癌組織和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位前列腺癌組織中的表達(dá)變化。2·運(yùn)用西安艾莉娜生物科技有限公司的乳腺癌組織芯片BR1321,采用免疫組織化學(xué)法檢測UBE2T在正常前列腺組織,原位前列腺癌組織和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的原位前列腺癌組織中的表達(dá)變化。[結(jié)果]1.采用免疫組織化學(xué)法檢測前列腺癌組織芯片中UBE2T的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明正常前列腺中UBE2T表達(dá)最低,原位前列腺癌中表達(dá)較高,而已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位前列腺癌中UBE2T的表達(dá)最為顯著。2.采用免疫組織化學(xué)法檢測前列乳癌組織芯片中UBE2T的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明正常乳腺中UBE2T表達(dá)最低,原位乳腺癌中表達(dá)較高,而已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位乳腺癌中UBE2T的表達(dá)最為顯著。3. UBE2T過表達(dá)的前列腺癌患者預(yù)后生存率明顯降低。[結(jié)論]1.前列腺癌和乳腺癌組織芯片的免疫組化結(jié)果證實(shí)UBE2T在已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原位腫瘤組織中表達(dá)最為顯著,在原位腫瘤組織中表達(dá)低于前者,正常組織中表達(dá)最低。這表明UBE2T與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切的相關(guān)性。第二部分UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、EMT及侵襲轉(zhuǎn)移[目的]第一部分結(jié)果提示UBE2T表達(dá)可能與前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān),我們希望通過相應(yīng)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤、轉(zhuǎn)移模型來驗(yàn)證UBE2T是否促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。[方法]1.采用UBE2T基因過表達(dá)質(zhì)粒pBabe-UBE2T及其對照空白質(zhì)粒,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法在前列腺癌細(xì)胞系Du145和PC3構(gòu)建UBE2T過表達(dá)細(xì)胞系及對照細(xì)胞系：Dul45-pBabe-UBE2T, Du145-pBabe, PC3-pBabe-UBE2T, PC3-pBabe。上述細(xì)胞系經(jīng)2ng/mL嘌呤霉素篩選后,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測UBE2T的表達(dá)改變。2.采用兩個UBE2T基因沉默質(zhì)粒pSuper-shUBE2T.A和pSuper-shUBE2T.D及對照空白質(zhì)粒,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法在前列腺癌細(xì)胞系Du145和PC3構(gòu)建UBE2T沉默細(xì)胞系及對照細(xì)胞系：Du145-pSuper-shUBE2T.A, Du145-pSuper-shUBE2T.D, Du145-pSuper, PC3-pSuper-shUBE2T.D PC3-pSuper。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系經(jīng)2ng/mL嘌呤霉素篩選后,RT-PCR:和Western blot檢測UBE2T的表達(dá)改變。3.應(yīng)用上述構(gòu)建的UBE2T過表達(dá)或沉默的細(xì)胞系,通過MTT和克隆形成檢測UBE2T對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。4.應(yīng)用上述構(gòu)建的UBE2T過表達(dá)細(xì)胞系,顯微鏡下觀察UBE2T對細(xì)胞形態(tài)的影響,通過western blot,免疫熒光和免疫組化等方法檢測UBE2T對EMT標(biāo)志蛋白(E-cadherin, Vimentin, Fibronectin, alpha-smooth muscle acting)表達(dá)的影響。5.應(yīng)用上述構(gòu)建的UBE2T過表達(dá)細(xì)胞系,通過劃痕實(shí)驗(yàn),Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測UBE2T對前列腺癌細(xì)胞運(yùn)動能力的影響；Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測UBE2T對前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。6.應(yīng)用穩(wěn)定過表達(dá)UBE2T的前列腺癌細(xì)胞系及其空白對照細(xì)胞系,通過皮下注射和尾靜脈注射的方式,建立裸鼠腫瘤生成模型和裸鼠遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型,檢測UBE2T對腫瘤生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響。7.應(yīng)用UBE2T沉默的前列腺癌細(xì)胞系及其空白對照細(xì)胞系,通過皮下注射和尾靜脈注射的方式,建立裸鼠腫瘤生成模型和裸鼠遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型,檢測UBE2T對腫瘤生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響。8.采用免疫組化的方法,檢測瘤體和轉(zhuǎn)移灶中UBE2T的表達(dá)。[結(jié)果]1.成功構(gòu)建UBE2T過表達(dá)前列腺癌細(xì)胞系及空白對照細(xì)胞系：Du145-pBabe-UBE2T, Du145-pBabe, PC3-pBabe-UBE2T, PC3-pBabe。2.成功構(gòu)建UBE2T沉默前列腺啊細(xì)胞系及空白對照細(xì)胞系：Du145-pSuper-shUBE2T.A, Du145-pSuper-shUBE2T.D, Du145-pSuper, PC3-pSuper-shUBE2T.D, PC3-pSuper。3.過表達(dá)UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖,同時沉默UBE2T能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長速度。4. UBE2T促使前列腺癌細(xì)胞由上皮細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。5.過表達(dá)UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞間質(zhì)分子標(biāo)志物(Vimentin, Fibronectin, alpha-SMA)的表達(dá),抑制上皮分子標(biāo)志物(E-cadherin)的表達(dá)。6. UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞體外遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力。7.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明UBE2T促進(jìn)前列腺腫瘤的生長。8.裸鼠轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)表明UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力。[結(jié)論]1. UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖。2. UBE2T具有調(diào)控前列腺癌細(xì)胞EMT及體外遷移、侵襲轉(zhuǎn)移的能力。3. UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。第三部分UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制究[目的]體外實(shí)驗(yàn)證明UBE2T能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲轉(zhuǎn)移,但是其作用機(jī)制尚不明確,該部分目的在于通過一系列實(shí)驗(yàn)探討UBE2T可能的分子機(jī)制。[方法]1.串聯(lián)親和質(zhì)譜分析(Tandem affinity purification and Mass Spectrometry, TAP-MS)檢測可能與UBE2T相結(jié)合的蛋白。2.利用前列腺癌組織芯片檢測UBE2T與靶蛋白Vimentin之間的相關(guān)性。3.通過western blot實(shí)驗(yàn),檢測在放線菌酮(CHX)作用下UBE2T對Vimentin蛋白半衰期的影響4.利用上述方法檢測另一靶向Vimentin的分子FBXW7對Vimentin半衰期的影響。5.通過免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP實(shí)驗(yàn),分析UBE2T, FBXW7和Vimentin三者之間的相互作用。6.通過western blot實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證UBE2T和FBXW7是否共同影響Vimentin的蛋白水平。7.通過Co-IP檢測UBE2T能夠影響FBXW7和Vimentin之間的結(jié)合及FBXW7對Vimentin的降解。8.通過系列點(diǎn)突變、Co-IP等試驗(yàn),分析UBE2T第95位氨基酸是否是UBE2T與Vimentin的結(jié)合位點(diǎn)。9.將UBE2T第95位氨基酸突變成同性質(zhì)的其他氨基酸,檢測突變后的UBE2T對前列腺啊細(xì)胞增殖,遷移及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。[結(jié)果]1. TAP-MS、蛋白半衰期等試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vimentin是UBE2T可能的靶蛋白之一。2.組織芯片結(jié)果表明在前列腺癌組織中UBE2T的表達(dá)水平與Vimentin的表達(dá)正相關(guān)。3. UBE2T能夠延緩Vimentin的降解,而FBXW7能夠促進(jìn)Vimentin的降解。4. UBE2T能夠抑制FBXW7所引起的Vimentin的降解。5. UBE2T能夠影響FBXW7與Vimentin之間的結(jié)合,從而影響Vimentin的表達(dá)。6. UBE2T第95位的氨基酸是UBE2T與Vimentin的結(jié)合位點(diǎn)。7. UBE2T第95位氨基酸突變能夠抑制UBE2T促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖,遷移及侵襲轉(zhuǎn)移的作用。[結(jié)論]1. Vimentin是UBE2T的靶蛋白,UBE2T能夠延緩Vimentin的降解。2. UBE2T影響Vimentin的降解通過抑制FBXW7與Vimentin之間的結(jié)合實(shí)現(xiàn)。3. UBE2T第95位的氨基酸是UBE2T與Vimentin的結(jié)合位點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2331215