【摘要】：肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是惡性腫瘤中最常見的一類,死亡率高,缺乏有效的治療手段。肝癌可由多因素導(dǎo)致,并呈漸進(jìn)性、多階段發(fā)展,但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道[5,6],肝癌的產(chǎn)生不僅與遺傳相關(guān),也同樣受到表觀遺傳修飾的影響。通過(guò)表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)的研究可為進(jìn)一步闡明肝癌發(fā)病機(jī)制,尋找藥物作用靶點(diǎn),研發(fā)治療肝癌的藥物開辟新的領(lǐng)域和新的途徑。表觀遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控等。蜂毒素是從蜂毒中提取出來(lái)的肽類物質(zhì),具有殺菌、抗炎和鎮(zhèn)痛和抗腫瘤作用等。本研究以HepG2和SMMC-7721細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,在明確蜂毒素抑制肝癌細(xì)胞增殖作用的基礎(chǔ)上,觀察了蜂毒素對(duì)MeCP2表達(dá)的調(diào)控及對(duì)Shh信號(hào)通路的影響,并探討蜂毒素對(duì)HDAC2表達(dá)的影響以及非編碼RNA MALAT1基因和microRNA Mir-203在其中發(fā)揮的作用,旨在闡明蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞中多種表觀遺傳學(xué)修飾的影響,為肝癌的研究與防治提供新的思路。具體研究?jī)?nèi)容包括以下五個(gè)部分：1、蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用采用MTT法檢測(cè)蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用,結(jié)果表明,蜂毒素(1、2和4μg/mL)可劑量依賴性抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖,可能不干擾SMMC-7721細(xì)胞的凋亡,但可提高SMMC-7721細(xì)胞G0/G1期百分比。Western blot結(jié)果顯示,蜂毒素(1、2和4 μg/mL)處理后SMMC-7721細(xì)胞cyclin D1和CDK4蛋白表達(dá)顯著降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖的抑制作用與其阻滯SMMC-7721細(xì)胞周期有關(guān)。2、蜂毒素對(duì)MECP2表達(dá)的調(diào)控及對(duì)SHH信號(hào)通路的影響MTT、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),MeCP2沉默能抑制細(xì)胞增殖,而MeCP2過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法檢測(cè)蜂毒素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MECP2表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),蜂毒素(1、2和4μg/mL)以濃度依賴性方式降低SMMC-7721細(xì)胞MeCP2的mRNA和蛋白表達(dá)。通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA-MeCP2和MeCP2質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),MECP2可能有助于蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)蜂毒素及MeCP2對(duì)SMMC-7721細(xì)胞SHH信號(hào)通路的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MeCP2能調(diào)節(jié)SHH信號(hào)通路,而蜂毒素能誘導(dǎo)PTCH1表達(dá)增高,而Shh和GLI1表達(dá)明顯降低。蜂毒素能顯著增加在轉(zhuǎn)染MeCP2質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞中已降低的PTCH1表達(dá),Shh和GLI1過(guò)表達(dá)明顯被抑制。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,蜂毒素在SMMC-7721細(xì)胞中通過(guò)下調(diào)MeCP2抑制SHH信號(hào)通路,從而抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖。3、蜂毒素對(duì)HepG2細(xì)胞HDAC2表達(dá)的調(diào)控采用MTT法、Hoechst染色、FCM檢測(cè),結(jié)果表明蜂毒素可劑量依賴性抑制HepG2細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測(cè)HDAC2 mRNA和蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,蜂毒素(1、2和4μg/mL)處理后HepG2細(xì)胞HDAC2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低,且與給藥濃度成負(fù)相關(guān)。4、沉默長(zhǎng)鏈非編碼長(zhǎng)鏈RNA MALAT1對(duì)蜂毒素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)蜂毒素對(duì)HepG2細(xì)胞中MALAT1表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),蜂毒素(1、4和8μg/mL)可顯著抑制HepG2細(xì)胞MALAT1 mRNA的表達(dá)。進(jìn)一步采用MALAT1特異性siRNAs沉默HepG2細(xì)胞中的MALAT1,通過(guò)MTT法和FCM法觀察MALAT1沉默后對(duì)蜂毒素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),沉默MALAT1能有效促進(jìn)蜂毒素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,蜂毒素可下調(diào)HepG2細(xì)胞株中MALAT1的表達(dá),沉默MALAT1能有效促進(jìn)蜂毒素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5、蜂毒素對(duì)非編碼微小RNA MiR-203表達(dá)及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot等檢測(cè)蜂毒素對(duì)MiR-203表達(dá)的影響以及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響,進(jìn)一步研究過(guò)表達(dá)Mir-203對(duì)P13K蛋白表達(dá)及PI3K/AKT信號(hào)通路的的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),蜂毒素(1、2和4 μg/mL)可上調(diào)SMMC-7721和HepG2細(xì)胞中Mir-203的表達(dá),下降P13K和P-AKT蛋白的表達(dá),但對(duì)編碼P13K蛋白的基因PIK3CA mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響。過(guò)表達(dá)Mir-203能在轉(zhuǎn)錄后水平靶向抑制P13K蛋白的表達(dá)并抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,蜂毒素上調(diào)Mir-203,在轉(zhuǎn)錄后水平抑制PIK3CA基因的表達(dá),抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化。綜上所述,蜂毒素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用是多靶點(diǎn)、多途徑的綜合性效應(yīng),可能涉及多種表觀遺傳修飾途徑,包括DNA甲基化修飾、組蛋白翻譯后修飾、非編碼RNA等。本研究結(jié)果表明表觀遺傳學(xué)修飾在蜂毒素抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2329567